染色體重排所導致的基因融合是腫瘤中的常見現(xiàn)象吗讶，在腫瘤的發(fā)生過程中起著非常重要的作用缸剪，約占人類癌癥發(fā)病率的20%白修。目前，國內(nèi)外已有多種抑制融合基因的腫瘤靶向治療藥物用于臨床寝贡，包括伊馬替尼/BCR-ABL1扒披、克唑替尼/EML4-ALK和拉羅替尼/NTRK融合等。
然而圃泡，融合基因發(fā)生的頻率在不同的癌癥中存在很大的差異碟案，許多融合基因只存在于特定的癌癥亞型。例如颇蜡，非小細胞肺癌（NSCLC）中ALK融合基因陽性率為3%~7%价说；僅2%的ROS1融合基因存在于肺癌患者中；所有實體瘤中NTRK基因融合陽性率平均約為1%风秤，而在某些特定腫瘤中卻高達90%[1,2]鳖目。
機遇與挑戰(zhàn)丨融合基因精準檢測如何實現(xiàn)？
因此缤弦，精確檢測融合基因不但可以協(xié)助臨床醫(yī)生對癌癥進行診斷和分型领迈，還能夠為后續(xù)的治療提供必要信息。目前，融合基因診斷主要包括熒光原位雜交(FISH)狸捅、IHC等衷蜓。然而，這些檢測方法的分辨率和通量通常較低薪贫，同時還較為依賴檢驗人員的判斷經(jīng)驗恍箭，而且往往只適用于已知的融合亞型，應(yīng)用拓展有限瞧省，因而常常導致診斷過程漫長扯夭、費用昂貴。如圖2所示鞍匾，由于Deletion區(qū)域較小交洗，導致探針仍然可以與目標區(qū)域結(jié)合，因此橡淑，F(xiàn)ISH結(jié)果并未檢測到GOPC-ROS1融合构拳，出現(xiàn)了假陰性的情況。有報道表明梁棠，使用IHC檢測NTRK3融合的靈敏度降低置森，其中，NTRK1和NTRK2的靈敏度分別為97%和99%符糊，而NTRK3只有79%凫海；此外，其特異性還與腫瘤類型相關(guān)男娄。[5]
盡管傳統(tǒng)檢測方法仍將作為腫瘤融合基因診斷的不可或缺的手段行贪，但與此同時，多種新型技術(shù)平臺也在逐步走進臨床（表1）模闲。例如建瘫，基于雜交/熒光或者質(zhì)譜技術(shù)的融合基因檢測手段在一定程度上避免了技術(shù)人員的主觀判斷，更加數(shù)字化尸折，在通量提高的同時還具有經(jīng)濟優(yōu)勢啰脚；但另一方面，現(xiàn)階段臨床研究已發(fā)現(xiàn)的腫瘤融合基因超過了10000種实夹，雖然以上技術(shù)都具有較高的檢測靈敏度拣播，但它們都不能發(fā)現(xiàn)新的融合亞型，仍存在一定局限性收擦。除此之外贮配，基于NGS的錨定擴增子技術(shù)雖然方便快捷，也不需要融合的先驗知識塞赂，但稍顯不足的是容易產(chǎn)生假陽性泪勒，需要利用生物信息管線過濾掉置信度低的融合基因。
多維對比丨RNA-Cap改善臨床融合基因檢測潛力巨大
值得關(guān)注的是，Hybridization-based DNA靶向測序技術(shù)（DNA-Cap）近年來憑借其經(jīng)濟圆存、不依賴融合先驗知識叼旋、新融合亞型的發(fā)現(xiàn)能力，以及適用于基因組和游離核酸的廣泛性沦辙、高靈敏度等諸多優(yōu)勢夫植，越來越多地被廣大臨床檢驗實驗室所采用。?
當前市面上油讯，多款基于NGS技術(shù)的DNA-Cap伴隨診斷產(chǎn)品都具有檢測融合基因的能力详民，例如MSK-IMPACT等。其整體流程如下：設(shè)計覆蓋功能基因內(nèi)含子區(qū)域的探針陌兑，將探針與預(yù)文庫雜交沈跨，捕獲測序，分析統(tǒng)計嵌合型Reads兔综，從而發(fā)現(xiàn)融合事件饿凛。但單獨使用DNA-Cap檢測融合基因也有一定的局限性：
1.?靈敏度
NGS技術(shù)的靈敏度與覆蓋度直接相關(guān)，有些內(nèi)含子非常長软驰，如NTRK3中的內(nèi)含子 (~193kb)涧窒。如果覆蓋，將進一步增加成本锭亏。此外杀狡，有些內(nèi)含子區(qū)域即使在需要的情況下也無法設(shè)計探針，因為它們包含了大量重復序列贰镣，會降低on-target，同時也較難比對膳凝。例如碑隆，ROS1的31號內(nèi)含子，作為主要融合區(qū)域（CD74/SLC34A2/SDC）蹬音，含有90%以上的重復序列上煤。因此，如果融合斷點涉及未覆蓋的內(nèi)含子區(qū)域著淆，而捕獲探針無法覆蓋這些區(qū)域劫狠，檢測靈敏度將受到影響。例如永部， 在某些FDA批準的腫瘤大Panel中独泞，對于NTRK融合通常采用熱點內(nèi)含子部分覆蓋和伴侶覆蓋（NTRK3-ETV6），可能有漏檢的風險（圖3）苔埋。
2.?特異性
不同的分析軟件導致的假陽性率不同懦砂，因此，有研究同時采用多種融合分析軟件以提高特異性[7]；更加值得注意的是荞膘，基因組層面的染色體重排或基因融合很難確認融合基因是否表達或功能性罚随。在一項基于NGS的DNA/RNA研究中，使用MSK-IMPACT Panel發(fā)現(xiàn)的23例NTRK融合陽性樣本羽资，其中21例確認具有融合轉(zhuǎn)錄本表達淘菩，兩例陰性樣本既沒有融合轉(zhuǎn)錄本表達（Archer RNA testing）也未檢測到融合蛋白（IHC），該研究顯示了對基因組融合進行驗證的重要性[8]屠升。
盡管有一些研究使用全轉(zhuǎn)錄組測序來檢測融合基因潮改，但是由于全轉(zhuǎn)錄組測序在病理檢測后，腫瘤臨床樣本多以FFPE為主的弥激，其RNA一般都有部分降解进陡，質(zhì)量較低∥⒎基于NGS的RNA-seq技術(shù)中趾疚，mRNA-seq局限性較大，在一項使用mRNA-seq對乳腺癌融合基因的研究中以蕴，只有45.7%（32/70）的融合基因可以被RT-PCR和Sanger方法驗證[9]糙麦；而使用去核糖體方法時，由于mRNA前體的存在丛肮，Intron含量增加赡磅、Exon占比較低，由于RNA降解宝与、去rRNA不充分焚廊，表現(xiàn)為有效數(shù)據(jù)低且不穩(wěn)定（1%-30% Exon ratio）；除此之外习劫，組織中的非目標基因還將進一步壓縮目標Exon的數(shù)據(jù)占比咆瘟。換言之，全轉(zhuǎn)錄組測序可以被理解為天然的“WES”诽里，但是由于基因的差異化表達袒餐，轉(zhuǎn)錄本覆蓋會參差不齊，同時又限于實驗技術(shù)（去核糖體谤狡、逆轉(zhuǎn)錄等）和生物學（mRNA前體）方面的影響灸眼，最終可能需要大量的數(shù)據(jù)量來提升RNA-seq對融合基因的檢測靈敏度和穩(wěn)定性（圖4）。
相較而言捕仔，RNA-Cap技術(shù)在融合基因檢測方面則可以克服上述諸多瓶頸宛徊。首先佛嬉，針對轉(zhuǎn)錄本設(shè)計探針避免了內(nèi)含子區(qū)域的干擾，有效地提高了靈敏度且Panel更小闸天、更加經(jīng)濟暖呕；其次，有效規(guī)避rRNA污染以及內(nèi)含子和非目標基因干擾苞氮，提高數(shù)據(jù)有效性和目標區(qū)域深度湾揽，增加檢測靈敏度（圖5）；更為重要的是笼吟，RNA-Cap還能夠在發(fā)現(xiàn)融合基因的同時對融合基因的功能（in-frame）和表達量進行評估库物，對融合基因進行二次驗證。正因如此贷帮，現(xiàn)在MSK-IMPACT對入選患者使用DNA-Cap和RNA錨定擴增子技術(shù)進行共檢測戚揭。?
同時評估基因組變異與變異基因表達，通過DNA&RNA共捕獲對融合基因的二維檢測方式锄禽，可以說是精準醫(yī)療發(fā)展的一個縮影潜必，從一藥一檢到腫瘤小Panel/大Panel，再到WES沃但，腫瘤伴隨診斷技術(shù)正以前所未有的速度不斷完善磁滚，相信隨著技術(shù)的成熟和測序成本的降低，高通量測序必將更好的服務(wù)于患者宵晚。
