NGS - Next Generation Sequencing, 以后可以用于個(gè)性化治療瓢喉，基因疾病和臨床診斷沪羔。
三種測(cè)序方法：https://www.zhihu.com/question/31549894
一代測(cè)序（Sanger Sequencing）
1976翎碑， 準(zhǔn)確率高殖属，被稱為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)颁糟。仍用于實(shí)際測(cè)序或用于驗(yàn)證NGS結(jié)果榛瓮。
Sanger法測(cè)序是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物,直到摻入一種鏈終止核苷酸為止铺董。每一次序列測(cè)定由一套4個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）禀晓，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）精续。由于ddNTP缺乏延伸所需的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性的在A,T,C,G處終止并在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記粹懒，產(chǎn)生以A,T,C,G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸驻右，然后再尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見的DNA堿基序列崎淳。
https://zhuanlan.zhihu.com/p/29270914
http://www.360doc.com/content/17/1101/00/33459258_699876240.shtml
https://www.nature.com/articles/nature24286
https://www.youtube.com/watch?v=jFCD8Q6qSTM
步驟：
- 得到DNA鏈段堪夭，加熱使DNA變性，雙鏈解成單鏈拣凹，并用其中一條作模板鏈森爽。（如何獲得純凈的單邊鏈？）
- fragmented DNA - 模板鏈打散成隨機(jī)小片段（500bp左右）嚣镜。
- 模板鏈溶液中爬迟，加入引物（primer），與模板鏈的3’位置結(jié)合（加引物是因?yàn)镈NA聚合酶不能重頭復(fù)制菊匿，需要前面有一小段起點(diǎn)）付呕。
- 加入DNA聚合酶，及正常DNA合成需要的4種正常堿基（dNTP）跌捆，A(腺嘌呤), T(胸腺嘧啶), C(胞嘧啶), G(鳥嘌呤)及摻入少量的標(biāo)記有不同熒光的能夠終止延長(zhǎng)反應(yīng)的特殊堿基(ddNTP)徽职。A，T佩厚，G姆钉，C，再進(jìn)行PCR（Polymerase Chain Reaction抄瓦，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）潮瓶。該特殊堿基一旦結(jié)合到鏈上便能終止DNA延長(zhǎng)，從而得到延長(zhǎng)程度不同的帶有不同末端的DNA鏈
- 將復(fù)制的DNA鏈通過毛細(xì)管電泳實(shí)現(xiàn)質(zhì)量/大小排序钙姊。（如何去重毯辅？）
- 排序后的DNA鏈通過激光器激發(fā)ddNTP熒光分析得到對(duì)應(yīng)的序列。
1979 Staden 鳥槍法測(cè)序（shotgun）
https://wenku.baidu.com/view/aa8e2cd6770bf78a652954d2.html?rec_flag=default&sxts=1535423640166
可能問題：
- 拼接錯(cuò)誤
- 分段不合適
- 重復(fù)序列的存在
- 字符串比對(duì)- 兩個(gè)字符串的距離
二代測(cè)序（大規(guī)模并行DNA測(cè)序技術(shù)）
NGS在人類基因組計(jì)劃完成的10年內(nèi)高速發(fā)展煞额，幾乎替代了Sanger測(cè)序思恐。
NGS技術(shù)在一些方法上與電泳測(cè)序明顯不同：
- 主要的變化是多路技術(shù)沾谜。不是每個(gè)反應(yīng)一管，而是將一個(gè)復(fù)雜的DNA模板庫固定到一個(gè)雙向表面上壁袄，所有的模板都可以與單個(gè)實(shí)際進(jìn)行反應(yīng)类早。
- 該技術(shù)更不是細(xì)菌克隆，而是在體外產(chǎn)生大量的測(cè)序模板嗜逻。
- 最后涩僻，也不是測(cè)量片段的長(zhǎng)度，而是測(cè)定生物化學(xué)循環(huán)（如聚合酶接到的熒光標(biāo)記核苷酸）和成像（也被稱為邊合成邊測(cè)序栈顷，Sequencing By Synthesis）逆日。
常用儀器
Illumina新推出了2017 NovaSeq-生產(chǎn)級(jí)；2018 iSeq-小型實(shí)驗(yàn)室萄凤。
- Illumina Miseq (實(shí)現(xiàn)重點(diǎn)的應(yīng)用室抽，如靶向重測(cè)序、元基因組靡努、小型基因組測(cè)序坪圾、靶向基因表達(dá)分析等,微生物測(cè)序)
- Illumina HiSeq 高通量
- Roche 454 Sequencer
- ABI SOLiD system
- Life Tech Ion Proton
2010年NGS市場(chǎng)：Illumina占69%，Life Tech占16%惑朦，Roche占15%兽泄。
http://www.ebiotrade.com/newsf/2015-11/2015111991347488.htm
歷史儀器：
第一個(gè)綜合的NGS平臺(tái)來自于2005年，即Solexa漾月。
在2005年病梢，454發(fā)布了第一個(gè)商業(yè)化的NGS儀器。
與人類基因組計(jì)劃期間美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)的壟斷不同梁肿，一些公司包括454（被羅氏收購）蜓陌、Solexa（被Illumina收購）、Agencourt（被美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI收購吩蔑，SOLiD）钮热、Helicos（由Quake成立）、Complete Genomics（由Drmanac成立）和Ion Torrent（由Rothberg成立哥纫，后被Life Technology在2010收購）在激烈地競(jìng)爭(zhēng)NGS霉旗，通過不斷出現(xiàn)的新儀器迅速改變了以上的壟斷情況，他們每年都會(huì)在硅谷的AGBT會(huì)議(Advances in Genome Biology & Technology蛀骇，基因組技術(shù)和生物進(jìn)展)上發(fā)布新的儀器。在2007到2012年間读拆，DNA測(cè)序的每個(gè)堿基的耗費(fèi)下降了4個(gè)數(shù)量級(jí)擅憔。
Sequencing By Synthesis步驟
https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing.html
http://www.funinusa.net/article-182005-1.html（中文）
Sample Preparation https://zhuanlan.zhihu.com/p/35278810
建庫，在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構(gòu)建文庫檐晕，文庫加載到測(cè)序芯片F(xiàn)lowcell
Add adaptors ->DNA fragments,包括sequencing binding site（Read1和Read2的測(cè)序引物結(jié)合區(qū)）暑诸， indice (用于區(qū)分不同樣本), binding site to flowcell oligos（接頭：與flow cell結(jié)合區(qū)）等-
Cluster Generation
簇生成蚌讼。文庫兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補(bǔ)，每條文庫片段都經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成一個(gè)簇
bridge amplification
Cluster Generation.png -
Sequencing
簇?cái)U(kuò)增及測(cè)序个榕。與步驟二同時(shí)進(jìn)行篡石。即在堿基延伸過程中，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)只能延伸一個(gè)正確互補(bǔ)的堿基西采，根據(jù)四種不同的熒光信號(hào)確認(rèn)堿基種類凰萨，保證最終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后械馆，完整讀取核酸序列胖眷。
Sequencing.png -
Data Analysis
Data Analysis.png
三代測(cè)序（實(shí)時(shí)單分子測(cè)序泌类，目前錯(cuò)誤率較高许昨，不適用臨床）：
- Single Molecule, Real-Time (SMRT)
Pacific Biosciences （PacBio） de novo組裝
Sequel System, SMRT technique
在實(shí)時(shí)測(cè)序中通過光學(xué)觀察聚合酶的合成。.
https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/
SMRT Techniques.png
- Nanopore
Oxford Nanopore (Oxford Nanopore Technologies, ONT) 便攜瞧壮，準(zhǔn)確率太低
https://nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing
Nanopore Sequencing.png
Genia（George Church大神力薦尾菇，已被Roche$125MM重金收購境析，希望不要被毀掉）
Illumina未公布
用途
De novo genome assembly 從頭基因組測(cè)序
Genome resequencing
通過對(duì)比參照基因組來檢測(cè)突變和種群差異。
Bowtie and Burrows–Wheeler Aligner (BWA) enable millions of reads to be efficiently mapped to the reference genome派诬。
Popular packages, initially SAMtools and later GATK, adapted the confidence framework of phred to NGS bases, reads and variants
- Clinical applications of sequencing
- NIPT(無創(chuàng)產(chǎn)前篩查劳淆，Non-Invasive Prenatal Testing)
- WES（whole exome sequencing,全外顯子測(cè)序）用于檢測(cè)胎兒孟德爾病及神經(jīng)發(fā)育障礙。
- 癌癥診斷
- Sequencers as a molecule counting device
hundreds of protocols were developed that facilitate the use of DNA sequencing as a ‘molecule counter’ for the characterization of a remarkable range of biochemical or molecular phenomena, including transcription, translation, DNA replication, the secondary structure of RNA, chromosome conformation, nucleic-acid modifications, post-translational modifications, nucleic acid–protein interactions and protein–protein interactions.
用于表征各種生物化學(xué)或分子現(xiàn)象千埃，包括轉(zhuǎn)錄憔儿，翻譯，DNA復(fù)制放可，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)谒臼，染色體構(gòu)象，核酸酸修飾耀里，翻譯后修飾蜈缤，核酸 - 蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。
- Metagenome sequencing
微生物環(huán)境基因組學(xué)冯挎。從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫底哥，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息.
未來
Genome diversity：多物種房官，多物質(zhì)（蛋白質(zhì)等）
Population-scale resequencing：對(duì)比得到基因突變數(shù)據(jù)
Developmental biology：ex vivo -> In situ -> in vivo genome editing
Real-time, portable sensors：ONT重70g趾徽，U盤大小。
Unconventional uses: nanopore可能用于監(jiān)測(cè)蛋白折疊翰守，化學(xué)納米機(jī)器等
