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研究背景：
成神經(jīng)細胞瘤(NB)是一種臨床異質(zhì)性的兒童交感神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤署尤，占總癌癥相關(guān)兒童的15%。近年來亚侠，多種基因組標(biāo)記物的鑒定有助于NB患者的風(fēng)險分層和生存率的提高曹体。發(fā)現(xiàn)PARP1基因的常見遺傳變異有可能預(yù)測高風(fēng)險NB患者的治療失敗∠趵茫患者經(jīng)歷化療耐藥或復(fù)發(fā)的比率仍然很高箕别，臨床實踐中的替代治療方案有限;因此，迫切需要制定額外的治療策略。腫瘤在基因和表型上都不是一個簡單的整體結(jié)構(gòu)的細胞串稀，而是由不同的細胞實體組成的更復(fù)雜的系統(tǒng)啥酱。在同一腫瘤內(nèi)，細胞可以通過復(fù)雜的遺傳和翻譯后修飾來適應(yīng)不同的選擇性環(huán)境壓力厨诸，從而產(chǎn)生了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)現(xiàn)象镶殷。單細胞測序(sc-seq)技術(shù)的引入為研究人員提供了一套新的工具來詢問ITH和了解腫瘤的起源和組成。應(yīng)用scRNA-seq來證明培養(yǎng)的細胞系再現(xiàn)了腫瘤中惡性細胞之間觀察到的異質(zhì)性微酬，因此建議將其用于癌癥研究绘趋。
研究結(jié)果：
一、順鉑和依托泊苷處理誘導(dǎo)細胞亞群形成颗管，具有不同的轉(zhuǎn)錄組特征
1陷遮、對兩對NB細胞系進行了單細胞RNA-seq (scRNA-seq): i) UKF-NB-4親本和UKF-NB-4耐順鉑(UKF-NB-4 CDDP)細胞系和ii) HTLA-230親本和HTLA-230耐依托泊苷 (HTLA-230 ER)細胞系。
2垦江、通過存活率和克隆試驗評估了UFK-NB-4和HTLA-230細胞系對順鉑和依托波苷的耐藥誘導(dǎo)帽馋。
3、經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和歸一化比吭，獲得了1514個UKF-NB-4 CDDP與2646個UKF-NB-4細胞以及1674個HTLA-230 ER與1160個HTLA-230細胞的轉(zhuǎn)錄譜绽族。這些細胞表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組譜。在這兩種細胞系中衩藤，耐藥細胞都與未處理的細胞分開聚集(圖1A,B)吧慢，這表明藥物治療(順鉑或依泊苷)顯著影響了這些細胞系的轉(zhuǎn)錄組。
4赏表、通過單細胞轉(zhuǎn)錄組譜的異質(zhì)性分析检诗，在UKF-NB-4中鑒定了3個簇，在UKF-NB-4 CDDP中鑒定了4個簇(圖1C)瓢剿，在HTLA-230中鑒定了4個簇逢慌，在HTLA-230ER中鑒定了4個簇(圖1D)。
二间狂、耐藥影響NB細胞的特性
1攻泼、在NB細胞系和腫瘤中，兩種表型分化的細胞以腎上腺素能(ADN)細胞和未分化間充質(zhì)(MES)細胞為主前标。
2坠韩、為了了解NB細胞身份是否參與化療耐藥性，評估了通過scRNA-seq分析獲得的細胞簇(CL)中已知ADN和MES特征的富集情況炼列。在UKF-NB-4 CDDP vs UKF-NB-4細胞中只搁，親本CL0、CL5和CL6簇的MES和ADN基因顯著富集(圖2A)俭尖，但與ADN簽名相比氢惋，MES簽名優(yōu)先呈現(xiàn)(圖2B)洞翩。
3、所有順鉑耐藥簇均強烈富集ADN基因(圖2A和B)焰望。
4骚亿、在親本HTLA-230細胞中，發(fā)現(xiàn)所有集群(CL0熊赖、CL1来屠、CL3和CL7)都富集ADN基因(圖2C)，與MES特征相比震鹉，CL3和CL7的表達明顯過高(圖2D)俱笛。
5、而在HTLA-230-ER細胞中传趾，發(fā)現(xiàn)所有簇都同樣富集MES和ADN基因(圖2C, D)迎膜，這些結(jié)果可能突出了依賴泊苷耐藥細胞的可塑性潛力，因此它們能夠從MES身份轉(zhuǎn)換浆兰，反之亦然磕仅。
三、ITH強調(diào)藥物潛在耐藥的發(fā)展
1簸呈、為了推斷與每個聚類相關(guān)的生物學(xué)特征榕订，使用了Seurat (FDR <0.01)對生物過程的基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫進行過度表示分析。然后對結(jié)果進行聚類以進行親和傳播蝶棋。圖2E和F繪制了兩張熱圖卸亮，匯總了每個聚類中按p值排序的前10個重要生物過程的結(jié)果。
2玩裙、在UKF-NB-4細胞中，觀察到兩個亞細胞簇具有顯著的生物學(xué)過程(FDR <0.01)(圖2E): CL0的特征是參與DNA和RNA代謝過程調(diào)控的基因通路段直，CL5的特征是與組織和器官發(fā)育相關(guān)的通路(如組織遷移吃溅、原腸胚形成、干細胞分化等)鸯檬。
3决侈、在HTLA-230細胞中，所有簇都顯示出顯著的生物過程富集(圖2F)喧务。亞細胞簇CL0的過表達基因參與組織和器官發(fā)育(圖2F)赖歌， CL1和CL3的過表達基因參與DNA和RNA代謝和基因表達過程，而CL7的過表達基因完全參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組織的生物過程功茴。
四庐冯、NB細胞株ITH可預(yù)測成神經(jīng)細胞瘤的預(yù)后
1、為了分析大隊列NB樣本中涉及耐藥的組成和生物學(xué)程序坎穿，使用UKF-NB-4 CDDP vs UFK-NB-4和HTLA-ER vs HTLA-230細胞的scRNA-seq聚類分析中得到的每個聚類的表達簽名來分解大量NB腫瘤的轉(zhuǎn)錄組展父。
2返劲、通過這種方法，在NB樣本(SEQC隊列)中觀察到的ITH與UKF-NB-4和HTLA-230細胞系群體中觀察到的ITH相當(dāng)(圖3A, B)栖茉。
3篮绿、事實上，觀察到吕漂，雖然屬于同一細胞群亲配，但不同的群集與不同的陽性或陰性臨床因素相關(guān)。例如(圖3C) CL0和CL5 (UKF NB-4細胞)分別與高風(fēng)險(HR)-NBs 和低風(fēng)險(LR)-NBs 相關(guān)惶凝，而CL2和CL3 (UKF NB4-CDDP細胞)分別與HR-NBs 和LR-NBs 相關(guān)弃榨。
4、同樣(圖3C)梨睁， CL3(屬于HTLA-230細胞)與HR-NBs 相關(guān)鲸睛，CL2和CL5(均屬于HTLA-230 ER細胞)分別與LR-NBs和HR-NBs 相關(guān)。
5坡贺、評估了其他具有預(yù)后意義的NB臨床參數(shù)官辈，如MYCN擴增(圖3D)、分期(圖3E)和腫瘤發(fā)病年齡(圖3F)遍坟，對于每個CL拳亿，評估了在風(fēng)險比較中觀察到的相同臨床相關(guān)性(圖3C)。
6愿伴、在UKF-NB-4 CDDP細胞中肺魁，CL2與評估的所有最差預(yù)后因素相關(guān)(圖3D,E,F): MYCN擴增， 4期隔节，診斷年齡鹅经，突出了更具侵襲性的細胞亞克隆的存在(由于順鉑治療)，并證實了GO分析中觀察到的生物學(xué)意義(圖2E)怎诫。
7瘾晃、在HTLA-230 ER細胞中，CL5(圖3D,E,F)與MYCN擴增幻妓、4期和NB發(fā)病年齡相關(guān)蹦误，這表明該細胞亞克隆可能是一個更具侵襲性的克隆(由于依托波苷治療);事實上，氧化石墨烯分析顯示了生物合成和代謝生物過程的豐富肉津。
8强胰、HTLA-230細胞的CL7以表達參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組織過程的基因為特征(圖2F)，與高生存率顯著相關(guān)妹沙，這加強了該CL由分化程度更高偶洋、侵襲性更低的細胞組成的假設(shè)。
9初烘、與不良臨床因素相關(guān)的集群CL0 (UFK-NB4)涡真、CL2 (UFK-NB4 CDDP)(圖3G)分俯、CL3 (HTLA-230)和CL5 (HTLA-230 ER)(圖3H)具有明顯的最差預(yù)后。
10哆料、CL2(順鉑耐藥細胞)和CL5(依賴泊苷耐藥細胞)特征在無反應(yīng)NB患者篩查中可能具有臨床意義(圖3G,H)缸剪。
總結(jié)：
在本研究中，研究了目前用于NB患者一線治療的對依泊苷和順鉑藥物耐藥的NB細胞系親本和單細胞水平的轉(zhuǎn)錄組譜的變化东亦。
本工作中描述的分析已經(jīng)證明了單細胞RNA數(shù)據(jù)在以下方面的實用性:
(1)識別不同的腫瘤細胞群杏节，確定耐藥的ITH及其親本NB細胞;
(2)發(fā)現(xiàn)耐藥對NB細胞鑒定的影響;
(3)揭示NB細胞系的ITH反映了NB腫瘤的細胞組成。
本研究已經(jīng)確定了在順鉑或依泊苷治療期間獲得的轉(zhuǎn)錄不同的細胞亞群的同時存在典阵，這些亞群聚集在親本NB細胞之外奋渔，強調(diào)了ITH現(xiàn)象及其與化療耐藥的聯(lián)系。此外壮啊，還證實了這兩種NB耐藥細胞系彼此聚集嫉鲸，進一步加強了ITH在NB耐藥中的作用。
