生信小課堂
研究背景：
成神經(jīng)細(xì)胞瘤(NB)是一種臨床異質(zhì)性的兒童交感神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤云芦，占總癌癥相關(guān)兒童的15%。近年來贸桶，多種基因組標(biāo)記物的鑒定有助于NB患者的風(fēng)險(xiǎn)分層和生存率的提高舅逸。發(fā)現(xiàn)PARP1基因的常見遺傳變異有可能預(yù)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)NB患者的治療失敗』噬福患者經(jīng)歷化療耐藥或復(fù)發(fā)的比率仍然很高琉历，臨床實(shí)踐中的替代治療方案有限;因此，迫切需要制定額外的治療策略水醋。腫瘤在基因和表型上都不是一個(gè)簡(jiǎn)單的整體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞旗笔，而是由不同的細(xì)胞實(shí)體組成的更復(fù)雜的系統(tǒng)。在同一腫瘤內(nèi)拄踪，細(xì)胞可以通過復(fù)雜的遺傳和翻譯后修飾來適應(yīng)不同的選擇性環(huán)境壓力蝇恶，從而產(chǎn)生了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)現(xiàn)象。單細(xì)胞測(cè)序(sc-seq)技術(shù)的引入為研究人員提供了一套新的工具來詢問ITH和了解腫瘤的起源和組成惶桐。應(yīng)用scRNA-seq來證明培養(yǎng)的細(xì)胞系再現(xiàn)了腫瘤中惡性細(xì)胞之間觀察到的異質(zhì)性撮弧，因此建議將其用于癌癥研究。
研究結(jié)果：
一姚糊、順鉑和依托泊苷處理誘導(dǎo)細(xì)胞亞群形成贿衍，具有不同的轉(zhuǎn)錄組特征
1、對(duì)兩對(duì)NB細(xì)胞系進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq (scRNA-seq): i) UKF-NB-4親本和UKF-NB-4耐順鉑(UKF-NB-4 CDDP)細(xì)胞系和ii) HTLA-230親本和HTLA-230耐依托泊苷 (HTLA-230 ER)細(xì)胞系救恨。
2贸辈、通過存活率和克隆試驗(yàn)評(píng)估了UFK-NB-4和HTLA-230細(xì)胞系對(duì)順鉑和依托波苷的耐藥誘導(dǎo)。
3肠槽、經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和歸一化擎淤，獲得了1514個(gè)UKF-NB-4 CDDP與2646個(gè)UKF-NB-4細(xì)胞以及1674個(gè)HTLA-230 ER與1160個(gè)HTLA-230細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。這些細(xì)胞表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組譜秸仙。在這兩種細(xì)胞系中揉燃，耐藥細(xì)胞都與未處理的細(xì)胞分開聚集(圖1A,B)，這表明藥物治療(順鉑或依泊苷)顯著影響了這些細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組筋栋。
4炊汤、通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的異質(zhì)性分析，在UKF-NB-4中鑒定了3個(gè)簇弊攘，在UKF-NB-4 CDDP中鑒定了4個(gè)簇(圖1C)抢腐，在HTLA-230中鑒定了4個(gè)簇，在HTLA-230ER中鑒定了4個(gè)簇(圖1D)襟交。
二迈倍、耐藥影響NB細(xì)胞的特性
1、在NB細(xì)胞系和腫瘤中捣域，兩種表型分化的細(xì)胞以腎上腺素能(ADN)細(xì)胞和未分化間充質(zhì)(MES)細(xì)胞為主啼染。
2宴合、為了了解NB細(xì)胞身份是否參與化療耐藥性，評(píng)估了通過scRNA-seq分析獲得的細(xì)胞簇(CL)中已知ADN和MES特征的富集情況迹鹅。在UKF-NB-4 CDDP vs UKF-NB-4細(xì)胞中卦洽，親本CL0、CL5和CL6簇的MES和ADN基因顯著富集(圖2A)斜棚，但與ADN簽名相比阀蒂，MES簽名優(yōu)先呈現(xiàn)(圖2B)。
3弟蚀、所有順鉑耐藥簇均強(qiáng)烈富集ADN基因(圖2A和B)蚤霞。
4、在親本HTLA-230細(xì)胞中义钉，發(fā)現(xiàn)所有集群(CL0昧绣、CL1、CL3和CL7)都富集ADN基因(圖2C)捶闸，與MES特征相比滞乙，CL3和CL7的表達(dá)明顯過高(圖2D)。
5鉴嗤、而在HTLA-230-ER細(xì)胞中斩启，發(fā)現(xiàn)所有簇都同樣富集MES和ADN基因(圖2C, D)，這些結(jié)果可能突出了依賴泊苷耐藥細(xì)胞的可塑性潛力醉锅，因此它們能夠從MES身份轉(zhuǎn)換兔簇，反之亦然。
三硬耍、ITH強(qiáng)調(diào)藥物潛在耐藥的發(fā)展
1垄琐、為了推斷與每個(gè)聚類相關(guān)的生物學(xué)特征，使用了Seurat (FDR <0.01)對(duì)生物過程的基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行過度表示分析经柴。然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類以進(jìn)行親和傳播狸窘。圖2E和F繪制了兩張熱圖，匯總了每個(gè)聚類中按p值排序的前10個(gè)重要生物過程的結(jié)果坯认。
2翻擒、在UKF-NB-4細(xì)胞中，觀察到兩個(gè)亞細(xì)胞簇具有顯著的生物學(xué)過程(FDR <0.01)(圖2E): CL0的特征是參與DNA和RNA代謝過程調(diào)控的基因通路牛哺，CL5的特征是與組織和器官發(fā)育相關(guān)的通路(如組織遷移陋气、原腸胚形成、干細(xì)胞分化等)引润。
3巩趁、在HTLA-230細(xì)胞中，所有簇都顯示出顯著的生物過程富集(圖2F)淳附。亞細(xì)胞簇CL0的過表達(dá)基因參與組織和器官發(fā)育(圖2F)议慰， CL1和CL3的過表達(dá)基因參與DNA和RNA代謝和基因表達(dá)過程蠢古，而CL7的過表達(dá)基因完全參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組織的生物過程。
四别凹、NB細(xì)胞株ITH可預(yù)測(cè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的預(yù)后
1草讶、為了分析大隊(duì)列NB樣本中涉及耐藥的組成和生物學(xué)程序，使用UKF-NB-4 CDDP vs UFK-NB-4和HTLA-ER vs HTLA-230細(xì)胞的scRNA-seq聚類分析中得到的每個(gè)聚類的表達(dá)簽名來分解大量NB腫瘤的轉(zhuǎn)錄組番川。
2到涂、通過這種方法脊框，在NB樣本(SEQC隊(duì)列)中觀察到的ITH與UKF-NB-4和HTLA-230細(xì)胞系群體中觀察到的ITH相當(dāng)(圖3A, B)颁督。
3、事實(shí)上浇雹，觀察到沉御，雖然屬于同一細(xì)胞群，但不同的群集與不同的陽(yáng)性或陰性臨床因素相關(guān)昭灵。例如(圖3C) CL0和CL5 (UKF NB-4細(xì)胞)分別與高風(fēng)險(xiǎn)(HR)-NBs 和低風(fēng)險(xiǎn)(LR)-NBs 相關(guān)吠裆，而CL2和CL3 (UKF NB4-CDDP細(xì)胞)分別與HR-NBs 和LR-NBs 相關(guān)。
4烂完、同樣(圖3C)试疙， CL3(屬于HTLA-230細(xì)胞)與HR-NBs 相關(guān)，CL2和CL5(均屬于HTLA-230 ER細(xì)胞)分別與LR-NBs和HR-NBs 相關(guān)抠蚣。
5祝旷、評(píng)估了其他具有預(yù)后意義的NB臨床參數(shù)，如MYCN擴(kuò)增(圖3D)嘶窄、分期(圖3E)和腫瘤發(fā)病年齡(圖3F)怀跛，對(duì)于每個(gè)CL，評(píng)估了在風(fēng)險(xiǎn)比較中觀察到的相同臨床相關(guān)性(圖3C)柄冲。
6吻谋、在UKF-NB-4 CDDP細(xì)胞中，CL2與評(píng)估的所有最差預(yù)后因素相關(guān)(圖3D,E,F): MYCN擴(kuò)增现横， 4期漓拾，診斷年齡，突出了更具侵襲性的細(xì)胞亞克隆的存在(由于順鉑治療)戒祠，并證實(shí)了GO分析中觀察到的生物學(xué)意義(圖2E)晦攒。
7、在HTLA-230 ER細(xì)胞中得哆，CL5(圖3D,E,F)與MYCN擴(kuò)增脯颜、4期和NB發(fā)病年齡相關(guān)，這表明該細(xì)胞亞克隆可能是一個(gè)更具侵襲性的克隆(由于依托波苷治療);事實(shí)上贩据，氧化石墨烯分析顯示了生物合成和代謝生物過程的豐富栋操。
8闸餐、HTLA-230細(xì)胞的CL7以表達(dá)參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組織過程的基因?yàn)樘卣?圖2F)，與高生存率顯著相關(guān)矾芙，這加強(qiáng)了該CL由分化程度更高舍沙、侵襲性更低的細(xì)胞組成的假設(shè)。
9剔宪、與不良臨床因素相關(guān)的集群CL0 (UFK-NB4)拂铡、CL2 (UFK-NB4 CDDP)(圖3G)、CL3 (HTLA-230)和CL5 (HTLA-230 ER)(圖3H)具有明顯的最差預(yù)后葱绒。
10感帅、CL2(順鉑耐藥細(xì)胞)和CL5(依賴泊苷耐藥細(xì)胞)特征在無(wú)反應(yīng)NB患者篩查中可能具有臨床意義(圖3G,H)。
總結(jié)：
在本研究中地淀，研究了目前用于NB患者一線治療的對(duì)依泊苷和順鉑藥物耐藥的NB細(xì)胞系親本和單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組譜的變化失球。本工作中描述的分析已經(jīng)證明了單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)在以下方面的實(shí)用性:(1)識(shí)別不同的腫瘤細(xì)胞群，確定耐藥的ITH及其親本NB細(xì)胞;(2)發(fā)現(xiàn)耐藥對(duì)NB細(xì)胞鑒定的影響;(3)揭示NB細(xì)胞系的ITH反映了NB腫瘤的細(xì)胞組成帮毁。本研究已經(jīng)確定了在順鉑或依泊苷治療期間獲得的轉(zhuǎn)錄不同的細(xì)胞亞群的同時(shí)存在实苞，這些亞群聚集在親本NB細(xì)胞之外，強(qiáng)調(diào)了ITH現(xiàn)象及其與化療耐藥的聯(lián)系烈疚。此外黔牵，還證實(shí)了這兩種NB耐藥細(xì)胞系彼此聚集，進(jìn)一步加強(qiáng)了ITH在NB耐藥中的作用爷肝。
