Day7
- 今天學(xué)習(xí)的是測序的相關(guān)知識替蔬，以測序原理為主，為以后的生信實戰(zhàn)奠定理論基礎(chǔ)
第一代測序技術(shù)——Sanger
第一代測序
第二代測序技術(shù)——以illumina為例
第二代測序
第三代測序技術(shù)
第三代測序
附上文本
第一代測序技術(shù)——Sanger
- 原理：利用雙脫氧核苷酸ddNTP來進(jìn)行復(fù)制合成栗精，而因ddNTP的3‘端沒有羥基，不能進(jìn)行延伸，就此終止峻汉，所以Sanger測序利用帶有特殊熒光的ddNTP與dNTP一起復(fù)制，會產(chǎn)生許多長度不等的子代產(chǎn)物脐往，其均有相同的5'端休吠，利用DNA電泳，根據(jù)不同位置即不同熒光业簿，便可讀取DNA序列
- 特點：先合成后讀取瘤礁，通量小，準(zhǔn)確度高梅尤，成本大
第二代測序技術(shù)——以illumina為例
- 第二代測序技術(shù)柜思，又叫NGS（下一代測序技術(shù)），其以通量高為優(yōu)點
- 原理：基礎(chǔ)元件是flowcell流動池巷燥，其上有多條lane泳道赡盘，以增大通量，每條泳道上有許多tile矾湃，其上有測序所需的cluster簇亡脑，用于PCR擴增以及之后的熒光測序，而這些簇就是人工種的具有化學(xué)修飾的DNA引物邀跃，該引物與之后測序的接頭序列相配對霉咨，且引物是以共價鍵與流動池相連的，在后續(xù)的沖洗中拍屑，不會被沖洗掉途戒。
- 第一步：先用超聲波等方式將DNA長鏈震碎，震成許多只有幾百bp的短鏈僵驰，再用klenow酶在3'端加一個A堿基補成平末端喷斋，后在短鏈的兩端接上與流動池上配對的接頭序列，形成DNA混合物蒜茴，即稱為DNA文庫星爪。
- 第二步：橋式pcr，將DNA混合物接到流動池上（接頭序列互補）粉私，再進(jìn)行DNA復(fù)制形成雙鏈顽腾，后用強堿打開雙鏈，將合成鏈沖洗掉（剩下一條與流動池相連的簇鏈）诺核，加入中性液體中和堿液抄肖，因有兩頭的接頭序列久信，簇鏈的另一端就可以和另一種引物互補，就可以再次復(fù)制合成雙鏈漓摩，再加堿沖洗裙士，如此重復(fù)多次，DNA的數(shù)量會以指數(shù)增長管毙，后將一個引物上的特定基團(tuán)切斷腿椎，使其一端與流動池連接，再用堿沖洗單鏈夭咬，就可以得到許多與流動池連接的DNA單鏈酥诽。
- 第三步，測序皱埠，加入測序引物，和帶熒光標(biāo)記的dNTP咖驮，且dNTP的3'端被一個疊氮基所堵塞边器，導(dǎo)致DNA復(fù)制不能進(jìn)行，一次循環(huán)延長一個堿基托修，機器讀取熒光忘巧，再通過化學(xué)反應(yīng)將疊氮基去掉，就可以連接下一個dNTP睦刃，如此重復(fù)砚嘴，可以得到許多短的單鏈DNA序列。
- 第四步涩拙，讀取index(barcode)际长，先用堿將測序合成的單鏈沖洗掉，再加入另一種測序引物兴泥，該引物位點在index旁工育，測序后就可以知道該單鏈來自哪個原始樣本
- 附，雙端測序搓彻，兩端都可以連接引物進(jìn)行測序如绸，使測序有效長度增加了一倍，即將一端引物切掉后旭贬，該種簇會斷掉怔接，繼而進(jìn)行另一種引物的測序工作即可
-特點：邊合成邊測序，通量大稀轨，成本低扼脐，但樣本準(zhǔn)備較繁瑣
第三代測序技術(shù)
①SMRT單分子測序
- 原理：以SMAT芯片上的零模波導(dǎo)納米孔（ZMW）為核心元件，ZMW是直徑只有幾十納米的小孔靶端，激光波長更大谎势，無法穿過凛膏，會形成衍射，在ZMW中利用帶熒光的dNTP進(jìn)行合成脏榆，讀取熒光信號測序
- 特點：邊合成邊測序猖毫，不用進(jìn)行PCR擴增，所需時間較短
②Oxford Nanopore 納米孔單分子通道技術(shù)
- 原理：其利用僅允許單個堿基通過的蛋白納米管道须喂，在膜兩側(cè)施加電壓吁断，通過檢測不同堿基在通過時所產(chǎn)生的微小的電流和電壓影響來判斷堿基類型
- 特點：檢測的是電信號而非熒光信號，適合單分子測序
請原諒我沒有配圖坞生，我是真的懶
