一蜡秽、測序過程和原理
Illumina測序是基于可逆終止的、熒光標(biāo)記dNTP來做邊合成缆镣、邊測序的工作芽突。
包括以下四個(gè)步驟：
1.DNA文庫構(gòu)建
DNA文庫是許多DNA片段在兩頭接上了特定的DNA接頭挟秤，形成的DNA混合物。有兩個(gè)特點(diǎn)：1.中間插入序列各種各樣2.兩頭的接頭序列是人為插上去的眠蚂。制作步驟為：超聲波將DNA分子打斷成300-800bp長序列片段煞聪，用酶補(bǔ)平為平末端，然后3‘端加一個(gè)A堿基（因?yàn)榻宇^的3‘端有一個(gè)突出的T）逝慧，再用連接酶將特定的接頭連上去昔脯。再在兩端加上互補(bǔ)配對的adapter，再通過PCR擴(kuò)增達(dá)到一定濃度笛臣，構(gòu)成單鏈DNA文庫云稚。
2.橋式PCR
橋式PCR是將DNA文庫種到流動(dòng)池上進(jìn)行擴(kuò)增的過程。文庫中兩頭的DNA序列和芯片上引物是互補(bǔ)的沈堡，產(chǎn)生互補(bǔ)雜交静陈。雜交后加入dNTP和聚合酶，合成新的DNA鏈诞丽。加入NaOH解鏈鲸拥，與芯片共價(jià)連接的鏈被保留。再加入中性液體中和堿液僧免，環(huán)境變成中性刑赶，這時(shí)DNA鏈上另外一段與芯片上第二段引物發(fā)生互補(bǔ)雜交。加入dNTP和聚合酶懂衩，聚合酶沿著第二條引物合成出一條新的鏈撞叨。再加堿仑乌，再中和依鸥，再加酶蔬充，再加dNTP仗嗦，DNA鏈的數(shù)量就會(huì)以指數(shù)方式增長。
橋式PCR完成后涛菠，就要把合成的雙鏈變成可以測序的單鏈残黑。即通過某一特定的堿性物質(zhì)將一個(gè)引物上特定的基團(tuán)切斷寝优，再用堿溶液清洗芯片苫亦。再加入中性溶液毛肋，加入測序引物奕锌，開始測序。
3.測序
測序時(shí)主要加入兩種物質(zhì)村生，一個(gè)是帶有熒光標(biāo)記、3‘末端被疊氮基堵住的dNTP饼丘，另一個(gè)是聚合酶趁桃。因?yàn)閐NTP 3‘末端被疊氮基堵住，所以一個(gè)循環(huán)只能延長一個(gè)堿基肄鸽。然后用水把多余的dNTP和酶沖掉卫病，放到顯微鏡下進(jìn)行激光掃描，根據(jù)發(fā)出來的熒光判斷是哪種堿基（紅黃藍(lán)綠）典徘，然后再推出模板上的堿基是哪個(gè)蟀苛。這個(gè)循環(huán)完成后，加入化學(xué)試劑逮诲，將疊氮基團(tuán)和熒光基團(tuán)切掉帜平，3‘端的羥基暴漏出來。接下來加入新的dNTP和新的酶梅鹦，又延長一個(gè)堿基裆甩，再?zèng)_掉，再掃描齐唆，再讀出來嗤栓。
讀index。在文庫的接頭上做標(biāo)記箍邮。每一個(gè)樣本中含有一個(gè)特定的接頭茉帅，每個(gè)接頭里含有一段特定的序列，稱為index锭弊。讀index序列前堪澎，先用堿把測完的read1序列解鏈掉，然后加入中性鏈廷蓉，加入read2的測序引物全封，進(jìn)行第二輪測序。就可以知道該DNA來自于哪個(gè)樣本桃犬。
雙端測序刹悴，一根DNA鏈從正向和反向各讀一遍。先合成互補(bǔ)鏈攒暇，用化學(xué)試劑土匀，在根上將原來的模板連切掉，剩下互補(bǔ)鏈形用。進(jìn)行read3的測序就轧。
4.數(shù)據(jù)產(chǎn)出
二证杭、測序類型
第一代DNA測序技術(shù)-雙脫氧鏈終止法。
第二代DNA測序技術(shù)-NGS循環(huán)陣列合成測序法妒御，解愤。讀長短，pcr技術(shù)增加了測序的錯(cuò)誤率
第三代DNA測序技術(shù)-納米孔單分子測序技術(shù)乎莉，超長讀長送讲，錯(cuò)誤率高。
