非靶向代謝組實(shí)驗設(shè)計
1.代謝物提取，一般要求每組至少10個樣；
2.在所有提取好的樣本中取等量混合作為QC滥嘴；
3.QC樣本與實(shí)驗樣本穿插上機(jī)，開始十個QC至耻，結(jié)尾三個QC若皱，中間每十個樣本穿插一個QC樣本
。
得到質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后得到峰表尘颓。
峰表格式一般為：每行為一個m/z走触，每列為一個樣本
數(shù)值表示該樣本中某個m/z的信號響應(yīng)。
第一列為保留時間_質(zhì)荷比來代表離子疤苹，如0.10_96.9574m/z互广。
數(shù)據(jù)分析流程
一般有如下幾點(diǎn)：
1.數(shù)據(jù)預(yù)處理。如缺失值過濾填充卧土、數(shù)據(jù)歸一化等惫皱。
2.數(shù)據(jù)質(zhì)控。包括CV分布尤莺、QC等旅敷。
3.統(tǒng)計分析。包括單變量颤霎、多變量等媳谁。
4.功能分析。包括Pathway友酱、網(wǎng)絡(luò)分析晴音、Biomarker篩選等。
1.數(shù)據(jù)預(yù)處理
缺失值處理
1）缺失原因
a. 信號很低檢測不到缔杉；
b. 檢測錯誤段多，如離子抑制或者儀器性能不穩(wěn)定；
c. 提峰的算法限制壮吩，不能從背景中將低的信號提取出來进苍；
d. 解卷積時不能將重疊的峰全部解析出來加缘。
2）缺失值過濾
比如：
QC樣本中缺失超過50%的去除；
樣本中缺失值超過80%的去除觉啊。
3）缺失值填充
-- 最小值填充
-- 平均值/中值填充
-- KNN（ k-nearest neighbour）填充
-- BPCA（Bayesian PCA）填充
-- PPCA（probabilistic PCA）填充
-- Singular Value Decomposition (SVD)
一般推薦KNN拣宏。
噪音信號去除
一般是低質(zhì)量的離子。
1）低質(zhì)量離子的確定：
計算某個離子在QC樣本中的RSD（標(biāo)準(zhǔn)差/均值）杠人；其值越小勋乾，說明偏差越小嗡善；
2）判斷標(biāo)準(zhǔn)：
-- 對單個離子峰而言辑莫，RSD<0.3，則該離子峰合格罩引，否則去除各吨；
-- 對于整體數(shù)據(jù)而言，RSD<0.3袁铐，峰所占比例>60%揭蜒，則整體數(shù)據(jù)合格；
樣本歸一化
目的是為了提高樣本間的可比性剔桨。
樣本間有差異性屉更，如不同人的尿液濃度不同，不能直接拿來比較洒缀。
可在采集前歸一化瑰谜，如肌酸酐歸一化；也可在采集后歸一化树绩，如sum萨脑，pqn，quantile等葱峡。對于數(shù)據(jù)分析而言砚哗，通常是后者，如總和歸一化（sum）砰奕。
數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換
下游的分析一般要求數(shù)據(jù)為正態(tài)分布或者高斯分布蛛芥；
所以數(shù)據(jù)通常要進(jìn)行Log轉(zhuǎn)化或power轉(zhuǎn)化，這兩者都能夠?qū)O大值的抑制效應(yīng)消除军援，并且能夠調(diào)整數(shù)據(jù)的分布仅淑，如下圖；
Log轉(zhuǎn)化對0值比較敏感胸哥，必須首先去除零值涯竟。
數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換——scaling
目的是消除極大值效應(yīng)。
對不同樣本中同一個m/z的強(qiáng)度差異過大進(jìn)行調(diào)整，極大值的存在往往會掩蓋較低值的變化特征庐船。
可將某個m/z在所有樣本中的強(qiáng)度的值银酬，除以一個因子（SD值）；
方法如auto (uv)筐钟，pareto（推薦）揩瞪，vast， range等篓冲。
相當(dāng)于上面樣本歸一化是為了樣本可比李破，scaling是為了離子可比。
2.數(shù)據(jù)質(zhì)控
QC樣本的TIC重疊情況
上圖分別是陰離子和陽離子模式下QC樣本的TIC重疊情況壹将。
一般認(rèn)為：
所有的QC樣本峰重疊良好嗤攻；
峰強(qiáng)度波動差別不大；
QC樣本中CV<30%的峰所占比例
PCA中QC樣本的聚集程度
QC樣本的相關(guān)性
上圖分別為歸一化前和歸一化后的數(shù)據(jù)诽俯。
3.統(tǒng)計分析
單變量分析
一次只分析一個變量妇菱，即一個m/z，考察不同組別不同樣本的這個m/z表達(dá)有無差異惊畏？
常見的方法有倍數(shù)分析恶耽，t檢驗密任，秩和檢驗颜启，方差分析等。
聚類分析
核心思想就是根據(jù)具體的指標(biāo)(變量)對所研究的樣品進(jìn)行分類浪讳；
聚類分析需要設(shè)定一個方法來衡量樣本間的相似性或者不相似性（常用歐式距離缰盏，相關(guān)性系數(shù)等）；
常見聚類的方法：系統(tǒng)聚類（層次聚類）淹遵、K-均值聚類等口猜。
K-均值首先要估計出將要分出幾個類，然后將全部的基因按照相似性的距離透揣，歸入這幾類中济炎。
K– means計算量要小得多，效率比層次聚類要高辐真。
無論哪種分類方法须尚，最終要分成多少類灶芝，并不是完全由方法本身來決定生兆，研究者應(yīng)結(jié)合具體問題而定呼盆。
聚類分析是一種探索性的數(shù)據(jù)分析方法恃慧。相同的數(shù)據(jù)采用不同的分類方法涣澡，也會的得到不同的分類結(jié)果污尉。分類的結(jié)果沒有對錯之分坟乾，只是分類標(biāo)準(zhǔn)不同啃沪。
使用聚類方法時，首先要明確分類的目的堪嫂，再考慮選擇哪些變量(或數(shù)據(jù))參與分類偎箫，最后才需要考慮方法的選擇。
多變量分析
1）PCA分析
以下分別是得分圖（樣本在新的坐標(biāo)系中的位置
）和載荷圖(loading圖皆串，原變量與主成分間的夾角)
PCA怎么看镜廉？
- 組內(nèi)差異
- 組間差異
- 異常樣本
- PC1與PC2得分
2）偏最小二乘法
PLSDA的圖和PCA類似。只是一種監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法愚战，事先給樣本分類娇唯，最后看能否將不同組分開。
用R2和Q2進(jìn)行模型評價寂玲。
R2是相關(guān)性系數(shù)塔插，表示這個模型的擬合效果，是一個定量的測量（范圍0-1）拓哟，意味著所建立的模型能在多大程度上代表真實(shí)的數(shù)據(jù)想许；
一般當(dāng)R2在0.7-0.8表示模型解釋能力較好，較差的模型的R2往往為0.2-0.3
Q2表示PLS-DA模型的預(yù)測能力断序；
一般Q2大于0.5表示預(yù)測能力較好流纹，并且R2與Q2的值應(yīng)該比較接近。
使用permutation test模型進(jìn)行過擬合檢驗违诗。
VIP ( Variable Importance in Projection)變量重要性投影
每一個m/z都有VIP值漱凝，表示這個m/z在某一個主成分上的投影，即重要程度诸迟；
一般我們使用第一茸炒、第二主成分的VIP來表示這個m/z對模型分型的貢獻(xiàn)程度，VIP>=1被認(rèn)為是具有顯著貢獻(xiàn)的阵苇。
代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析最后兩部分內(nèi)容——功能分析和生物標(biāo)志物篩選見下節(jié)內(nèi)容
