1盯质、m6A methylated EphA2 and VEGFA through IGF2BP2/3 regulation promotes vasculogenic mimicry in co...

3研究目標:m6A修飾與colorectal cancer (CRC袁串,結(jié)直腸癌)的關系

1、 METTL3在結(jié)直腸癌中高表達并與臨床特征相關

(1)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC相關的RNA-seq數(shù)據(jù)呼巷,許多與RNA m6A修飾相關的蛋白表達量存在明顯差異囱修,即:

-?與癌旁正常組織相比,4個writer蛋白(METTL3王悍、METTL16破镰、RBM15和Virma)和6個reader蛋白(YTHDF1、YTHDF2压储、hnRNPA2B1鲜漩、HNRNPC和IGF2BP2/3)在CRC組織中的表達量顯著上調(diào);

- FTO的表達量被明顯下調(diào)集惋;

- 其它相關蛋白孕似,如WTAP、RBM15B等沒有明顯變化刮刑。

(2)METTL3在CRC的不同階段的表達不同喉祭,并且Kaplan-Meier生存分析表明METTL3高表達的CRC患者的生存率更低;

(3)比較8組CRC樣本和6組CRC細胞系顯示:與癌旁正常組織相比雷绢,CRC樣本或者細胞系中METTL3明顯更高泛烙;

(4)m6A dot blot assay進一步證實了CRC中的m6A修飾水平明顯更高,同時习寸,6個CRC細胞系(HT29、LoVo傻工、DLD-1霞溪、SW480、SW620和HCT116)中中捆,NCM460鸯匹、METTL3的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào),這與CRC組織中的結(jié)果一致泄伪;

(5)HCT116細胞系中具有更高的METTL3表達殴蓬,因此對其進行進一步分析。

2、轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)EphA2和VEGFA是影響血管發(fā)育的METTL3的直接靶點

(1)使用CRISPR-Cas9生成穩(wěn)定的METTL3-KO(M3KO)HCT116細胞系染厅,并使用qRT-PCR和western blotting驗證痘绎,同時m6A dot blot證實M3KO之后,m6A水平被明顯下調(diào)肖粮;

(2)對WT和M3KO的HCT116細胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)盡心分析孤页,鑒定到247個基因被顯著下調(diào)和181個被顯著上調(diào)。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)涩馆,差異表達基因在MAPK和PI3K-AKT信號通路中被顯著富集行施;

(3)選取10個在M3KO中被顯著下調(diào)的基因作為候選基因,并使用qRT-PCR進行表達量確認魂那,結(jié)果顯示與正常細胞系相比蛾号,有8個基因(Egr1、TRIB3涯雅、DDIT4鲜结、CLDN1、JAG1斩芭、PDE4D轻腺、VEGFA和EphA2)在M3KO中確實被明顯下調(diào);

(4)使用SRAMP划乖、RMBase2.0和BERMP數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)贬养,EphA2和VEGFA的3‘UTR,尤其是終止密碼子附近包含有高置信度的m6A修飾位點琴庵。

3误算、鑒定METTL3介導的m6A修飾參與EphA2和VEGFA的靶向調(diào)控

(1)使用MeRIP-qPCR對EphA2和VEGFA上的m6A進行鑒定,結(jié)果顯示M3KO之后迷殿,兩個基因上的m6A修飾明顯減少了儿礼;

(2)通過將野生型和“DRACH”突變的EphA2和VEGFA的3'UTR區(qū)域添加到熒光素酶報告基因的后面,來進一步確認METTL3對通過m6A修飾參與EphA2和VEGFA的表達調(diào)控庆寺。結(jié)果顯示蚊夫,敲除甲基化酶METTL3或者過表達去甲基化酶FTO之后,帶野生型的3'UTR區(qū)域的熒光素酶活性明顯下調(diào)懦尝,而帶m6A突變的3'UTR區(qū)域的熒光素酶活性則不受影響知纷;

(3)qRT-PCR和Western印跡分析證實,抑制METTL3或FTO過表達降低了HCT116細胞中EphA2和VEGFA的表達水平陵霉。同時琅轧,METTL3的減少或FTO的過度表達導致m6A水平下降。

這些結(jié)果證實了:EphA2和VEGFA是METTL3的靶標踊挠,并受METTL3以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)

4乍桂、METTL3基因敲除后依賴m6A-IGF2BP2/3途徑來增強EphA2和VEGFA mRNA的穩(wěn)定性

(1)TCGA數(shù)據(jù)的COAD分析顯示,CRC中 IGF2BP的水平與EphA2和VEGFA水平成正相關,暗示著m6A識別蛋白IGF2BP可能參與EphA2和VEGFA表達的正調(diào)控睹酌。同時發(fā)現(xiàn)在CRC中权谁,IGF2BP2/3均高表達;

(2)使用siRNAs沉默IGF2BP2和IGF2BP3的表達之后(qRT-PCR和WB驗證)忍疾,發(fā)現(xiàn)IGF2BP2基因敲除顯著降低了HCT116細胞中EphA2的表達闯传,但不影響VEGFA的表達,而IGF2BP3的表達降低則抑制了VEGFA的表達卤妒;

(3)RNA半衰期檢測結(jié)果顯示:在HCT116細胞中甥绿,EphA2和VEGFA的mRNA水平最初被降低,并且在METL3被敲除后则披,這些mRNA分子的半衰期持續(xù)顯著縮短共缕。另外,IGF2BP2基因敲除后EphA2 mRNA的半衰期也顯著縮短士复,而在IGF2BP3 siRNA處理的細胞中EphA2半衰期卻沒有變化图谷;相反,IGF2BP3 siRNA抑制后VEGFA mRNA半衰期顯著減少阱洪,而在IGF2BP2抑制后VEGFA mRNA半衰期卻保持不變便贵。

總結(jié):EphA2和VEGFA轉(zhuǎn)錄本上的m6A被不同的m6A“閱讀器”(即IGF2BP)識別。IGF2BP2與EphA2上的m6A結(jié)合冗荸,而IGF2BP3識別VEGFA上的m6A承璃,以增強EphA2/VEGFA mRNA的穩(wěn)定性,防止其降解蚌本,并通過m6A-IGF2BP2/3依賴的機制增加其表達盔粹。

5、METTL3修飾的EphA2/VEGFA通過PI3K/AKT和ERK1/2信號轉(zhuǎn)導來促進結(jié)直腸癌細胞中的VM(Vasculogenic Mimicry)

(1)四甲基偶氮唑鹽比色法( MTT assay)結(jié)果顯示:METTL3沉默可抑制細胞增殖程癌,過表達EphA2或VEGFA可挽救這一作用舷嗡。此外,共表達EphA2和VEGFA的METTL3基因敲除細胞的增殖能力比單獨高表達EphA2或VEGFA的細胞更強嵌莉;

(2)體外細胞克隆實驗結(jié)果顯示:METTL3缺失的細胞克隆形成率顯著降低进萄,EphA2/VEGFA過表達可挽救∪袂停跨膜遷移和侵襲實驗結(jié)果表明:METTL3缺失顯著抑制了細胞的遷移和侵襲中鼠,而EphA2/VEGFA的過表達明顯損害了結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲,無論是單獨過表達還是聯(lián)合過表達只祠;

(3)VM是腫瘤快速增殖所必需的兜蠕,而EphA2和VEGFA是這一過程中的重要分子扰肌。利用基質(zhì)凝膠和HCT116細胞分析了體外VM的形成抛寝,HCT-116細胞在基質(zhì)凝膠中產(chǎn)生了不同大小的部分管狀結(jié)構(gòu);然而,在METTL3被敲除后盗舰,這些管狀結(jié)構(gòu)沒有形成晶府。有趣的是,Hct-116細胞在體外的VM形成明顯被EphA2(KD-M3+EP)或VEGFA(KD-M3+VE)的過表達所修復钻趋,EphA2和VEGFA(KD-M3+EP/VE)的共同表達檢測到更多的管狀結(jié)構(gòu)川陆,這些數(shù)據(jù)表明,METTL3介導的EphA2/VEGFA激活有助于VM的形成蛮位。

(4)通過檢測METTL3抑制和過表達EphA2/VEGFA后较沪,p-AKT和p-ERK1/2的表達變化,結(jié)果表明:METTL3基因敲除抑制了AKT和mTOR的磷酸化失仁,而EphA2和VEGFA的過表達部分逆轉(zhuǎn)了因METTL3基因敲除誘導的PI3K/AKT/mTOR通路激活的情況尸曼。上皮性標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)在METTL3基因敲除后升高,EphA2或VEGFA過表達后降低萄焦。VM的標志物血管內(nèi)皮細胞鈣粘蛋白(Vientin)的表達在METTL3下調(diào)后也受到抑制控轿,而當EphA2和VEGFA過表達時增加。

(5)為了進一步研究METTL3對體內(nèi)VM形成的影響拂封,我們建立了裸鼠移植瘤茬射,然后將M3KO和對照HCT116細胞注射到每只小鼠的側(cè)翼,并在第13天后每隔3天測量一次腫瘤體積冒签,結(jié)果顯示:M3KO的腫瘤明顯小于對照組(p<0.01)在抛,并且其的EphA2和VEGFA的表達水平明顯低于對照組(p<0.001)。同樣镣衡,CD31染色顯示霜定,METTL3基因敲除的異種移植瘤中VM顯著減少。此外廊鸥,METTL3基因敲除組的p-AKT/p-mTOR和p-ERK1/2表達均低于WT對照組望浩。在穩(wěn)定的METTL3基因敲除組中,vimentin的表達水平也顯著降低惰说,而E-鈣粘蛋白的表達水平則較高磨德;

總結(jié): 首先,METTL3甲基化EphA2和VEGFA的mRNA吆视,隨后其上的m6A被m6A“閱讀器”IGF2BP2/3識別典挑,以維持/增強了其mRNA的穩(wěn)定性和表達。EphA2和VEGFA的表達增加通過激活PI3K/AKT和ERK1/2信號通路促進結(jié)直腸癌的進展啦吧,從而促進VM的形成您觉。

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