RNA m6A修飾無疑是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)中最受關(guān)注的研究內(nèi)容之一铺根，目前的研究已經(jīng)表明霉晕，m6A可能影響mRNA的運輸笼痛、降解、翻譯以及代謝等方方面面容燕，這種轉(zhuǎn)錄后修飾參與多種病理生理過程梁呈。mRNA m6A研究該注意哪些問題？高通量測序獲得的差異甲基化分子該如何挑選蘸秘？下游分子實驗該如何設(shè)計官卡？紐科生物長期關(guān)注并參與RNA m6A修飾的課題，我們精心篩選并整理了有關(guān)m6A研究的常見問題醋虏，結(jié)合近期發(fā)表的m6A文獻(xiàn)綜述寻咒，給各位老師提供全面答疑。
參考文章封面：
mRNA m6A修飾的位點序列灰粮、分布特征：
1）什么樣的序列會發(fā)生m6A修飾（序列偏好性）仔涩？m6A甲基化修飾主要受METT3/METTL14酶調(diào)控，修飾特征序列為DRACH（D:A\G\U粘舟，R=A\G熔脂，H=A\C\U），但是注意柑肴，并不是所有符合該序列規(guī)則的序列都能被甲基化霞揉，僅有小部分含有DRACH motif序列的片段能發(fā)生m6A修飾。目前文章中通常使用motif分析（圖1）進(jìn)行序列富集的結(jié)果展示晰骑。
2）修飾通常發(fā)生在什么區(qū)域适秩，UTR還是CDS區(qū)（區(qū)域偏好性）？研究顯示m6A目前主要發(fā)生在終止密碼子附近和基因內(nèi)部較長的外顯子中（圖2）硕舆，根據(jù)數(shù)據(jù)表明秽荞，基因內(nèi)部外顯子中長度超過200nt的個數(shù)占所有內(nèi)部外顯子個數(shù)的15%，但是這些外顯子中有近80%有m6A修飾位點抚官，出現(xiàn)這個現(xiàn)象的原因并不是因為這些較長的內(nèi)部外顯子存在大量的motif扬跋，事實上這些外顯子只含有30%左右的motif序列。臨近可變多聚腺苷酸化（APA）m6A事件要多于遠(yuǎn)端APA位點凌节。 METTL3/METTL14調(diào)控的m6A修飾系統(tǒng)并不僅僅受限于DRACH序列钦听，還有更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制共同決定m6A修飾的發(fā)生位置。
3）什么因素決定m6A的位置選擇（調(diào)控過程）倍奢？內(nèi)部朴上、外部因素共同決定調(diào)控m6A修飾位點選擇與過程，m6A調(diào)控蛋白（Writer, Eraser和Reader）和靶基因作為一個系統(tǒng)卒煞，內(nèi)部和外部是針對該系統(tǒng)進(jìn)行定義痪宰，實際上m6A如何發(fā)生以及怎樣發(fā)生通常是受很多因素共同調(diào)控的，內(nèi)部因素包括特定序列與METTL3/METTl14的結(jié)合偏好性，外部因素主要依賴于轉(zhuǎn)錄因子酵镜，RNA結(jié)合蛋白（例如TARBP2）碉碉，RNA聚合酶，H3K36me3組蛋白修飾可以募集METTL3/METTL14到mRNA并催化發(fā)生m6A修飾淮韭，當(dāng)然FTO和ALKBH5也能在METTL3/METTL14之后在對m6A修飾水平進(jìn)行改變垢粮。但是在這樣一個復(fù)雜的系統(tǒng)中，多種因素如何共同決定m6A位點選擇的疑問仍然沒有被完全解答靠粪。
圖3：m6A修飾的調(diào)控系統(tǒng)
（https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105977）
4）既然有內(nèi)外部因素共同決定蜡吧，哪個占主導(dǎo)？如果外部因素占主導(dǎo)占键，那么理論上m6A修飾會成為一個高度動態(tài)的過程昔善，細(xì)胞狀態(tài)改變，多種外部調(diào)控因素也會改變畔乙，m6A水平理應(yīng)對不同狀態(tài)下包括RBP在內(nèi)的這些外部因素會有動態(tài)應(yīng)答君仆；如果內(nèi)部因素占主導(dǎo)，那么甲基化酶的改變會影響整體m6A的修飾牲距，但不同位點m6A水平變化是相對有限的返咱；也有可能內(nèi)、外部調(diào)控機(jī)制交織在一起牍鞠，共同調(diào)控m6A修飾的位置咖摹、區(qū)域和水平，該問題還需要進(jìn)一步研究难述。
5）除了m6A本身變化以外萤晴，有其他重要因素影響m6A調(diào)控嗎？有胁后，那就是RNA m6A閱讀蛋白店读，也就是通常說的Reader蛋白，Reader蛋白也會競爭性的結(jié)合m6A位點攀芯，且Reader蛋白本身的結(jié)合水平和表達(dá)水平都會對m6A修飾基因產(chǎn)生影響两入，這就是為什么有時我們看到當(dāng)m6A水平并沒有發(fā)生改變時，不同比例敲才、水平的Reader蛋白也會造成被修飾基因發(fā)生改變的主要原因，當(dāng)然發(fā)生在Reader蛋白上的翻譯后修飾也能對Reader蛋白自身的酶活择葡、細(xì)胞定位以及結(jié)合親和性產(chǎn)生影響紧武，所有這些綜合起來共同對mRNA m6A進(jìn)行調(diào)控（圖4）。
圖4：YTH家族蛋白參與mRNA的代謝敏储、翻譯和降解（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33928028/#&gid=article-figures&pid=figure-1-uid-0）
6）修飾的特異性的作用：這種修飾特異性帶來的最直接影響是m6A介導(dǎo)的基因選擇性表達(dá)阻星，一旦m6A集中在特定部分轉(zhuǎn)錄本群體時，m6A 閱讀蛋白的調(diào)控系統(tǒng)就會發(fā)揮重要功能。在研究示例中妥箕，小鼠胚胎干細(xì)胞mESCs中80%能調(diào)控多能性的基因都受到m6A修飾滥酥，這種修飾促進(jìn)這些轉(zhuǎn)錄本的清除，從而讓細(xì)胞狀態(tài)由多能性轉(zhuǎn)向胚胎干細(xì)胞分化畦幢。不同位置的m6A修飾也有可能影響表達(dá)坎吻，m6A介導(dǎo)的調(diào)控效果依據(jù)位置的不同而不同。
圖5：Mettl3 KO ESCs resist termination of na?ve pluripotency
（m6A mRNA methylation facilitates resolution of na?ve pluripotency toward differentiation）
7）m6A mRNA的作用是什么宇葱？m6A修飾影響mRNA的降解和翻譯是目前主要觀點瘦真。YTHDF家族蛋白（包括YTHDF1、YTHDF黍瞧、YTHDF）在內(nèi)的m6A閱讀蛋白調(diào)控m6A靶分子降解和翻譯诸尽。最早研究的YTHDF2可以通過多種途徑造成m6A mRNA發(fā)生降解，比如募集CCR4-NOT復(fù)合物或者RNase P/MRP復(fù)合物至m6A mRNA使其發(fā)生降解印颤；YTHDF1您机、YTHDF3調(diào)控靶mRNA的翻譯，YTHDF1募集eIF3蛋白年局，YTHDF3協(xié)同YTHDF1共同影響靶mRNA的翻譯际看，當(dāng)然IGF2BP1、IGFBP2和IGFBP3也會結(jié)合m6A修飾轉(zhuǎn)錄本并增強(qiáng)其穩(wěn)定性（圖4）某宪。
8）如果進(jìn)行高通量測序之后仿村，靶點的挑選和下游實驗該如何進(jìn)行？通過上述解答不難看出兴喂，對于m6A修飾通常是基因蔼囊、位點、區(qū)域衣迷、功能特異的畏鼓，因此如果在進(jìn)行高通量測序之后選擇靶點時，首先應(yīng)當(dāng)考慮靶分子的功能壶谒，該分子應(yīng)當(dāng)同所研究的疾病和生物學(xué)過程具有緊密的聯(lián)系（如在肝癌中選擇SOCS2）云矫，其次應(yīng)當(dāng)考慮該位點相關(guān)測序參數(shù)，如甲基化倍數(shù)改變（fold change）和該分子的表達(dá)倍數(shù)改變汗菜，從上述問題可以明確看到不同的調(diào)控機(jī)制給靶基因帶來不同的影響让禀，因此要重點關(guān)注轉(zhuǎn)錄本甲基化水平改變的同時也要關(guān)注表達(dá)改變，此外還可以結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析陨界，從上述問題中可以發(fā)現(xiàn)部分RBP和轉(zhuǎn)錄因子本身對m6A修飾也會產(chǎn)生影響巡揍，參考其他RBP相關(guān)數(shù)據(jù)庫（POSTAR、RMBase等）可以綜合考慮是否在下游實驗設(shè)計當(dāng)中嵌入其他分子（尤其是Reader蛋白）菌瘪，綜合以上信息進(jìn)行挑選靶點對下游的研究故事完整性有很大幫助腮敌。
RNA m6A修飾仍然是當(dāng)下最火的科研熱點之一，有關(guān)RNA m6A的相關(guān)研究還在繼續(xù)，我們將在接下來的推送中為大家解決更多具有代表性的科研問題糜工，請各位老師持續(xù)關(guān)注弊添。
