Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system
這篇文章真的看了好久对妄，就算一開始秉承著不求甚解的精神都看不下去，有太多的專業(yè)背景需求敢朱，直到昨天做完了T7 Endonuclease I digestion實驗剪菱，回過頭再來看這篇protocol文章，終于能明白了百分之七八十了拴签。
但這篇文章長達29頁孝常，實在是不適合一頁一頁的翻看，看到后面前面已經(jīng)忘記了蚓哩，所以今天我將這篇文章的框架摘抄出來构灸，整理如下：
ABSTRACT--略
INTRODUCTION--5個小標題
1. Precise genome editing using engineered nucleases
簡單的背景介紹，說明精確編輯的重要性岸梨，有什么樣的核酸酶喜颁。
2. Cas9: an RNA-guided nuclease for genome editing
詳細介紹Cas9，并且介紹sgRNA曹阔。
3. Comparison with other genome editing technologies
簡單的對比一下不同的基因編輯工具的優(yōu)缺點半开，突出CRISPR-Cas9的優(yōu)點
4. Limitations of the Cas9 system
簡述CRISPR-Cas9的缺點
5. Experimental design
終于到實驗設(shè)計部分了
(1) Target selection for sgRNA.
先確定要干嘛（敲除還是編輯），然后設(shè)計sgRNA
(2) Approaches for sgRNA construction and delivery.
確定sgRNA的表達方式次兆，既然Cas9是需要sgRNA幫助來識別靶點的稿茉，那么sgRNA在細胞內(nèi)該如何產(chǎn)生呢？這里提供了兩種辦法芥炭，PCR擴增法還有質(zhì)粒表達法漓库。
(3) Design of repair template.
這部分是設(shè)計模板，HDR（同源修復(fù)）有兩種模板园蝠，一種是我們設(shè)計好插入到質(zhì)粒中渺蒿，另外一種呢是ssODN。想清楚選擇哪一種彪薛。
(4) Clonal isolation of cell lines.
將帶sgRNA表達的質(zhì)撩埃或者載體+模板一起轉(zhuǎn)染細胞，并且最后通過篩選標記分離（抗生素抗性或者熒光篩選）善延。
(5) Functional testing.
驗證基因編輯的效果少态。
MATERIALS--實驗材料和試劑
1. REAGENTs
sgRNA preparation, Mammalian cell culture, genotyping analysis
2. REAGENT SETUP
PROCEDURE--實驗步驟
1. 確定要用什么材料，sgRNA還是ssODN
一般來說 sgRNA是幫助Cas9識別靶點易遣，而Cas9造成DNA的雙劍斷裂（DSB）切口之后彼妻，DNA需要自我修復(fù)（DNA總不能一直斷著吧）。
這時候呢，沒有模板的就是易出錯的同源修復(fù)侨歉，會造成缺失（敲除）屋摇，那么有模板的呢，這部分模板就會接上去幽邓，就造成了插入炮温，這就是我們常說的HDR。
那么說到HDR是需要模板的牵舵，模板又分為兩種柒啤，一種呢是在質(zhì)粒上的，另一種比較簡單棋枕，是ssODN白修。
因此，首先要確定的是重斑，到底是想做敲除呢兵睛，還是想做插入。
1.1 Design of targeting components and the use of the CRISPR Design Tool ● TIMING 1 d
1.2 Design of the ssODN template (optional) ● TIMING 1 h
2. 確定好之后開始action
Preparation of sgRNA expression construct窥浪，因為我們要做的是敲除祖很，并且選擇了質(zhì)粒sgRNA的方法，所以首先要設(shè)計sgRNA漾脂，并將sgRNA插入到質(zhì)粒中
(A) Generation of the sgRNA expression construct by PCR amplification ● TIMING 2 h
(B) Cloning sgRNA into the pSpCas9(BB) vector for co-expression with Cas9 ● TIMING 3 d
3. 功能測試
第一部分自然是先轉(zhuǎn)染細胞假颇，將材料都轉(zhuǎn)進去。
Functional validation of sgRNAs: HEK 293FT cell culture and transfections ● TIMING 3–4 d** 先拿293FT細胞做轉(zhuǎn)染驗證
Co-transfection of CRISPR plasmids and HDR templates into HEK 293FT cells (optional) ● TIMING 3–4 d** 這是我們前面提到的骨稿，如果要做HDR修復(fù)的話笨鸡，那就需要模板，需要將質(zhì)粒和模板共轉(zhuǎn)坦冠。
hESC (HUES 9) culture and transfection ● TIMING 3–4* 因為多能干細胞和普通細胞的轉(zhuǎn)染是不一樣的形耗，所以單獨放出來給大家參考。
第二部分就是我們說的篩選細胞
Isolation of clonal cell lines by FACS ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通過熒光篩選細胞的實驗步驟辙浑。
Isolation of clonal cell lines by dilution ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通過挑單克隆的方法篩選
第三部分就是編輯效果
Functional testing: detection of indel mutations by the SURVEYOR nuclease assay ● TIMING 5–6 h 通過SURVEYOR核酸酶實驗驗證效果激涤，這部分我沒有用這個酶，我們用的是T7 Endonuclease I判呕，這個酶可以識別DNA上錯配的地方倦踢，然后給切開。
Functional testing: detection of genomic microdeletions by PCR ● TIMING 3–4 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通過PCR實驗驗證刪除和倒置侠草。
(A) Deletion or microdeletion analysis
(B) Inversion analysis
Functional testing: genotyping of HDR-mediated targeted modifications by restriction-fragment length polymorphism (RFLP) analysis ● TIMING 3–4 h 限制性片段長度多態(tài)性驗證HDR介導(dǎo)的基因編輯結(jié)果辱挥。這個名詞好長，看起來不好理解边涕，實際上就是晤碘，不好理解。可以自行百度一下就知道了哼蛆。
Assessment of Cas9 cleavage or HDR-mediated target modi?cation ef?ciency by Sanger sequencing ● TIMING 3 d 測序驗證
Deep sequencing and off-target analysis ● TIMING 2–3 d 脫靶效應(yīng)
總覽
思路圖
