簡單整理一下：
protocol-使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯（一）http://www.reibang.com/p/bfb34ba1050d
protocol-使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯（二）http://www.reibang.com/p/fb693b81748b
因?yàn)闆]看懂又中途跑去看了一波中文
CRISPR-Cas9學(xué)習(xí)筆記 http://www.reibang.com/p/b9d2a7203e6c
差不多的時(shí)候席覆，在師兄帶領(lǐng)下入录，學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)了一下sgRNA（講真院促，這部分我真是什么都不懂委乌，全靠師兄演示之后再自行補(bǔ)充背景知識(shí)）
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA設(shè)計(jì) http://www.reibang.com/p/8222f449cb44
此外司草，還有穿插學(xué)習(xí)的內(nèi)容
Cre-LoxP條件性基因編輯系統(tǒng)--學(xué)習(xí)筆記 http://www.reibang.com/p/ccae8b289cab
FLP-FRT系統(tǒng)--誘導(dǎo)性基因編輯inducible gene editing http://www.reibang.com/p/a70e7c2b83d0
設(shè)計(jì)了sgRNA之后怎么辦呢搬泥？秸架？還是這篇文章
先講一下這里的框架
（1）首先是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
Experimental design
1. Target selection for sgRNA--選擇靶點(diǎn)
2. Approaches for sgRNA construction and delivery. sgRNA的釋放方式
3. Design of repair template. 設(shè)計(jì)修復(fù)模板
4. Clonal isolation of cell lines.分離目的細(xì)胞
5. Functional testing.功能驗(yàn)證
（1）Experimental design
1. Target selection for sgRNA--選擇靶點(diǎn)
詳情見：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA設(shè)計(jì) http://www.reibang.com/p/8222f449cb44
2. Approaches for sgRNA construction and delivery.
sgRNA的合成和投遞有兩種方式：A）PCR；B）單獨(dú)的sgRNA的表達(dá)質(zhì)粒救鲤。
A）PCR擴(kuò)增的方法
U6：來源于人U6小核啟動(dòng)子久窟，常用小RNA 表達(dá)，轉(zhuǎn)錄本為shRNA本缠。
將sgRNA放到U6后面刽沾，利用U6的啟動(dòng)來擴(kuò)增sgRNA器仗。
將這部分內(nèi)容整合到Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9表達(dá)質(zhì)粒）中践险，一起共轉(zhuǎn)馏谨。
優(yōu)點(diǎn)： This method is optimal for rapid screening of multiple candidate sgRNAs, as cell transfections for functional testing can be performed shortly after obtaining the sgRNA-encoding primers. Because this simple method obviates the need for plasmid-based cloning and sequence verification, it is well suited for testing or co-transfecting a large number of sgRNAs for generating large knockout libraries or other scale-sensitive applications. 快速、簡便楣黍、研究多匾灶。
B）sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的方法
現(xiàn)在我要用這個(gè)方法來舉例
優(yōu)點(diǎn)：Construction of an expression plasmid for sgRNA is also simple and rapid, involving a single cloning step with a pair of partially complementary oligonucleotides. B方法一樣高效快捷
介紹一下這些質(zhì)粒：
（1）The oligo pairs encoding the 20-nt guide sequences are annealed and ligated into a plasmid (pSpCas9(BB))：包含可插入sgRNA target序列位點(diǎn)的Cas9的質(zhì)粒，這個(gè)質(zhì)粒叫做pSpCas9(BB
（2）Cas9 alone (pSpCas9)：只有Cas9的質(zhì)粒
（3）包含篩選標(biāo)記的質(zhì)粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP and pSpCas9(BB)-2A-Puro
（4）有用于Cas9 HDR及DSB的D10A nickase mutant （D10A切口酶突變）的質(zhì)粒：pSpCas9n(BB)-2A-GFP租漂，pSpCas9n(BB)-2A-Puro)
(b) Schematic for co-transfection of the Cas9 expression plasmid (pSpCas9) and a PCR-amplified U6-driven sgRNA expression cassette.
(c) Schematic for scarless cloning of the guide sequence oligos into a plasmid containing Cas9 and the sgRNA scaffold (pSpCas9(BB)).
設(shè)計(jì)p53引物
找到包括sgRNA序列的前后1000個(gè)堿基的序列（2000 bp）
找到的序列如下：
將上面復(fù)制的序列粘貼到blast中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
系統(tǒng)反饋說我提交的序列和數(shù)據(jù)中的某基因很像阶女，問我是不是就用下面這個(gè)。
選和不選我都試過了哩治，選擇的話秃踩，得到的引物有兩對(duì)，如下（摘選了其中一個(gè)）：
如果不選的話
摘選一個(gè)引物：發(fā)現(xiàn)兩種都可以得到比較好的引物业筏，但是后者的引物有不少錯(cuò)配憔杨，前者的引物質(zhì)量看起來更好（而且可以看到primer幾乎是均勻的橫跨1 kb大小，說明map到target上很好蒜胖，后續(xù)驗(yàn)證knockout的時(shí)候也會(huì)好做）消别。
3. Design of repair template. 設(shè)計(jì)修復(fù)模板
這幾個(gè)詞不知道要看多少遍抛蚤，我承認(rèn)，我不止一次看到它妖啥，但是我每次都無法精確理解其中的含義
error-prone NHEJ pathway
都說修復(fù)方式有兩種
（1）NHEJ：nonhomologous end joining霉颠，非同源末端結(jié)合对碌，這個(gè)方式在沒有修復(fù)模板的情況下發(fā)生的荆虱。
（2）HDR：homology-directed repair，同源直接修復(fù)朽们。這個(gè)方式是在有修復(fù)模板的情況下怀读。
修復(fù)模板：（1）plasmid-based donor repair templates that contain homology arms flanking the site of alteration，也就是有一個(gè)供體質(zhì)粒骑脱，質(zhì)粒有兩端同源序列（互補(bǔ)DSB用）菜枷，兩段同源序列之間就是我們要插入或者修改的內(nèi)容。同源臂通常大于500 bp（2）single-stranded DNA oligonucleotides (ssODNs)叁丧，emm啤誊。。拥娄。就是需要兩條單鏈寡核苷酸（ssODN）蚊锹，兩臂也是帶有同源序列（30~60個(gè)堿基，但為了提高效率稚瘾，最好是大于40個(gè)）牡昆，在Cas9切開雙鏈之后，模板的兩臂同源序列直接互補(bǔ)（HDR摊欠，同源修復(fù)）丢烘，從而完成了基因編輯。聰不聰明些椒！
上傳一張自己的理解圖
1.jpg
4. Clonal isolation of cell lines將已編輯的細(xì)胞分離開來
這個(gè)很好理解播瞳，在編輯片段中加入抗生素抗性基因或者熒光基因后，可通過抗生素篩選或者FACS分離免糕。
5. Functional testing功能驗(yàn)證
In cells co-transfected with a pair of sgRNAs to mediate a genomic (micro)deletion or inversion, indel mutations can be detected either by the SURVEYOR nuclease assay or by sequencing. Our online CRISPR Design Tool provides recommended primers for both approaches. 好了赢乓，那么大概的意思就是，咱們想辦法檢測到indel mutation说墨，也就是檢測我們動(dòng)過的地方骏全，可以使用surveyor核酸酶實(shí)驗(yàn)，也可以使用測序（當(dāng)然這樣更好啦）
（1）SURVEYOR nuclease assay
（2）Detection of indels or HDR by sequencing.
測序啦尼斧！
感謝師兄DZ
