用單細(xì)胞測(cè)序探究了兩種生物材料對(duì)新冠的治療機(jī)制然后發(fā)在Biomaterial（IF: 12.479）上舷礼，是個(gè)發(fā)文新思路哦

1. Immune profiling of COVID-19 ICU patient blood reveals distinct monocyte subsets associated with clinical outcome

流式檢測(cè)了新冠患者外周血免疫細(xì)胞比例鸭蛙。主要分組是給/沒(méi)給糖皮質(zhì)激素和恢復(fù)/死亡。可以看到，和既往報(bào)道一致支救，不管有沒(méi)有給激素也不管患者預(yù)后，新冠患者都存在淋巴細(xì)胞減少和粒細(xì)胞增多(A-G)拷淘，但CD4和CD8 T, NKT, NK, 嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例都沒(méi)有差別(B-I)各墨。盡管總的單核細(xì)胞比例沒(méi)有變化，但是沒(méi)有給糖皮質(zhì)激素的患者中辕棚，和恢復(fù)的患者相比欲主，死亡的患者CD16^-單核細(xì)胞 (classical) 比例增加，而CD16⁺單核細(xì)胞(non-classical和intermediate) 比例減少逝嚎。在給了糖皮質(zhì)激素的患者中則沒(méi)有出現(xiàn)這種變化(J-L)。有可能是因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素具有免疫調(diào)節(jié)功能详恼。

人的外周血單核細(xì)胞主要根據(jù)CD14和CD16（FCGR3A）的表達(dá)來(lái)區(qū)分:
classical (CD14++CD16-)
non-classical (CD14+CD16++)
intermediate (CD14++CD16+)
參考：單核巨噬細(xì)胞

2. Longitudinal profiling of serum and endotracheal aspirate (ETA) from COVID-19 ICU patients reveals elevated levels of DAMPs and PAMPs that potently activate nucleic acid-sensing TLR signaling

此前研究顯示补君，CD16⁺單核細(xì)胞主要參與TLR7/8介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，CD16^-單核細(xì)胞主要參與TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)¹昧互。

Fig 1的結(jié)果提示挽铁，沒(méi)有給糖皮質(zhì)激素的患者的單核亞群出現(xiàn)了變化，所以后面主要對(duì)沒(méi)有給糖皮質(zhì)激素的患者數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析敞掘。而且由于主要是CD16單核在變化叽掘，這兩類(lèi)細(xì)胞又對(duì)不同的TLR起反應(yīng)，所以作者下一步分析了新冠患者血漿和氣管內(nèi)抽吸物(ETA)活化不同TLR的能力玖雁。
在檢測(cè)的四個(gè)TLR中（TLR3識(shí)別雙鏈RNA更扁，TLR7識(shí)別單鏈RNA，TLR4識(shí)別LPS/HMGB1等，TLR9識(shí)別病毒DNA/線粒體DNA等）浓镜，所有病人的不同時(shí)間點(diǎn)的血漿可以較一致的激活TLR3和TLR7溃列。TLR4和TLR9也有升高，但是不如TLR3和TLR7那么明顯膛薛。
作者還檢測(cè)了ETA樣品听隐，發(fā)現(xiàn)它出現(xiàn)比血漿更為顯著的對(duì)四種TLR的激活作用（比血漿高3-4倍），提示肺臟局部炎癥反應(yīng)比外周血更重哄啄。

HEK-Blue?報(bào)告細(xì)胞系是一系列從人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）衍生的細(xì)胞系雅任，其設(shè)計(jì)用于通過(guò)監(jiān)測(cè)NF-κB的活化來(lái)研究各種PRR信號(hào)通路。HEK-Blue?細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)目標(biāo)PRR基因咨跌，此外沪么，HEKBlue?被轉(zhuǎn)染分泌性胚胎堿性磷酸酶（SEAP）報(bào)告基因，由融合了五個(gè)NF-κB和AP-1結(jié)合位點(diǎn)的最小啟動(dòng)子調(diào)控虑润。PRR配體如二醭擅担化脂蛋白和三酰化脂蛋白（分別為T(mén)LR2/TLR6拳喻、TLR2/TLR1）哭当、胞漿肽聚糖（NOD1/2）或β-葡聚糖（Dectin-1a/b）刺激均可激活NF-κB和AP-1，從而誘導(dǎo)SEAP的產(chǎn)生冗澈。使用InvivoGen的QUANTI-Blue?溶液則能夠輕易檢測(cè)SEAP的水平钦勘。參考：https://www.invivogen.com/innate-immunity；QUANTI-Blue? Solution 檢測(cè)亚亲，定量分析堿性磷酸酶

3. Nucleic acid-binding microfibers can deplete DAMPs/PAMPs from COVID-19 ICU patient serum and ETA and limit their ability to stimulate TLRs and induce downstream NFκB activation

因?yàn)橛^測(cè)到了新冠ICU患者的外周血和ETA樣品都出現(xiàn)很強(qiáng)的活化TLR的能力彻采，TLR又是由DAMPs/PAMP活化的，所以作者下一步探究了Nucleic acid-binding microfibers（核酸結(jié)合超細(xì)纖維捌归？）對(duì)DAMPs/PAMP的清除能力和對(duì)外周血TLR活化及其下游NFkB通路的影響

這個(gè)纖維就不多做介紹了肛响，知道在之前的研究里它可以清除外周DAMPs就可以了。畢竟這篇發(fā)在Biomaterials上惜索，主要就是做材料的

可以看到給了Fiber組的血漿和ETA特笋，活化TLR3, 4, 7, 9的能力都顯著下降(A-H)，這個(gè)纖維過(guò)濾之后的患者血漿和ETA巾兆，DNA, RNA, HMGB-1和nucleosomes都顯著下降(I-P)猎物。
因?yàn)檫@個(gè)fiber具有蛋白濾過(guò)功能，作者也查看了它對(duì)血漿正常蛋白albumin的影響角塑，發(fā)現(xiàn)影響相對(duì)較小(Q-R)蔫磨，提示它安全性較好。

4. Single-cell RNA sequencing of COVID-19 patient monocytes reveals phenotypic differences and DAMP/PAMP response patterns specific for clinical outcome

為了進(jìn)一步探究不同結(jié)局的COVID-19 ICU患者圃伶，作者取了新冠患者外周血單核細(xì)胞（根據(jù)預(yù)后分為去世和恢復(fù)）堤如，體外給了media (control)蒲列、LPS (TLR4激動(dòng)劑，PAMP激活的陽(yáng)性對(duì)照)煤惩、R848 (TLR7/8激動(dòng)劑嫉嘀，模擬患者肺臟和外周血中存在的TLR7/8 agonist）處理后進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。

Fig 4A-B：三組單核細(xì)胞的umap圖和六組（前面三組區(qū)分了CD16⁺和CD16^-）的樣品死亡/恢復(fù)的患者這兩組的PCA圖魄揉〖粑辏可以看到，在media處理組死亡/恢復(fù)的CD16⁺和CD16^-細(xì)胞是分不開(kāi)的洛退，在給了LPS/R848之后就獨(dú)立聚成團(tuán)瓣俯，提示不同結(jié)局新冠患者單核細(xì)胞的功能差異參與了TLR介導(dǎo)的抗病毒免疫失調(diào)（？略牽強(qiáng)兵怯，這個(gè)分面umap圖也有點(diǎn)奇怪）彩匕。
Fig 4C：上：在對(duì)照組(media處理)的CD16^-單核在去世和恢復(fù)組之間沒(méi)有差異基因。相反媒区，去世患者的CD16⁺單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄profile與hyper-inflammatory activation相一致驼仪，出現(xiàn)了IL1A，IFI27和TNFAIP6等基因的升高袜漩⌒靼郑恢復(fù)患者則有更高的適應(yīng)性免疫基因的表達(dá)，比如HLA-DRB5（??之前很多文獻(xiàn)報(bào)道新冠患者外周血單核細(xì)胞出現(xiàn)HLA下調(diào)宙攻，這個(gè)上調(diào)是相對(duì)去世患者的單核表達(dá)較高）奠货。中圖和下圖則是分別比較了LPS和R848處理的CD16^-和CD16⁺細(xì)胞在去世和恢復(fù)患者間的差異基因。整體來(lái)看座掘，CD16⁺單核細(xì)胞的差異基因還是要多很多递惋。
Fig 4D：差異基因富集結(jié)果
This observation supports the hypothesis that CD16⁺ monocytes are key regulators of COVID-19 immunopathology and harbor biomarkers associated with clinical outcomes.
Fig 4E F：差異基因的UpSetR，可以明顯看到CD16⁺單核細(xì)胞的差異基因更多

Fig 4

分離自去世患者的單核細(xì)胞溢陪，給TLR激動(dòng)劑處理后顯示出和monocyte tolerance相一致的轉(zhuǎn)錄表型萍虽。單核細(xì)胞由長(zhǎng)時(shí)間接觸大量免疫介質(zhì)可以引起monocyte tolerance。在前面的數(shù)據(jù)中可以看到去世患者的CD16⁺ monocytes不管是給了media還是TLR激動(dòng)劑都出現(xiàn)了相似水平的S100A8/A9(circulating calprotectin)和SIGLEC9高表達(dá)形真。此前文獻(xiàn)報(bào)道SIGLEC9可以通過(guò)CCR7調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的耐受^2-4贩挣。這個(gè)現(xiàn)象在恢復(fù)了的患者中則沒(méi)有觀察到。

為了進(jìn)一步探究這個(gè)現(xiàn)象没酣，作者使用了非負(fù)矩陣分解鑒定了和臨床預(yù)后相關(guān)的基因表達(dá)模式。
Fig 5A：恢復(fù)患者的未經(jīng)TLR激動(dòng)劑處理的CD16⁺ monocytes特征性表達(dá)pattern 3 (Immune tolerance signatures/CoGAPS pattern) 卵迂，而去世患者未經(jīng)TLR激動(dòng)劑處理的CD16⁺ monocytes有一個(gè)sub-population低表達(dá)pattern 3裕便，提示這個(gè)亞群的細(xì)胞缺乏功能活性，而恢復(fù)患者的細(xì)胞則有competent免疫反應(yīng)见咒。
Fig 5B C：pattern 3 score >0.5的CD16⁺單核與其它所有CD16⁺單核比較的差異基因和富集結(jié)果偿衰。
Fig 5D-F：LPS處理組
Fig 5G-I：R848處理組

Fig 5

5. Monocyte gene network analyses distinguish TLR activation responses associated with ICU patient outcome

轉(zhuǎn)錄因子分析，根據(jù)前面的結(jié)果，作者著重關(guān)注了CD16⁺單核
Fig 6A-C：media處理的恢復(fù)患者CD16⁺單核富集到EGR3和JUND regulon（激活A(yù)P-1轉(zhuǎn)錄因子下翎，調(diào)節(jié)抗病毒免疫）缤言，LPS和R848處理的恢復(fù)患者CD16⁺單核都富集到STAT1, STAT2和STAT4 regulon (STAT蛋白可以通過(guò)誘導(dǎo)干擾素表達(dá)限制病毒感染)。但是R848處理的恢復(fù)患者CD16⁺單核CEBPB和ATF4 regulon活性降低视事。The induction of ATF4 activity by TLR4 signaling interacts with CEBPB to regulate the production of inflammatory cytokines including IL-6, IL-8, and TNF-α胆萧。
Fig 6D-F：NFkB是最經(jīng)典的促炎通路，結(jié)果顯示死亡患者的單核細(xì)胞media處理狀態(tài)下就存在一定活化俐东。給了LPS/R848之后跌穗，恢復(fù)患者CD16⁺單核出現(xiàn)顯著的NFkB活化，死亡患者則沒(méi)有明顯變化虏辫。
Fig 6G-I：與前面的結(jié)果一致蚌吸，作者發(fā)現(xiàn)死亡患者的CD16⁺單核中NFκB inhibitor--NFKBIA和JUND的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。在baseline砌庄，恢復(fù)患者單核細(xì)胞表達(dá)高水平JUND(A)羹唠，而死亡患者單核細(xì)胞則表達(dá)高水平NFKBIA。LPS/R848刺激后娄昆，恢復(fù)患者的CD16⁺單核表達(dá)NFKBIA和JUND佩微，死亡患者則沒(méi)有共表達(dá)，提示JUND表達(dá)是過(guò)度刺激NFκB信號(hào)通路的一種補(bǔ)償反應(yīng)稿黄。

Taken together with our DAMP/PAMP profiling studies, these results suggest that the high levels of nucleic acid-containing DAMPs/PAMPs present in patients may lead to immune tolerance in ICU patients that succumb to COVID-19.

6. Longitudinal proteomics reveals markers of heightened myeloid activation and consumption of PAMP carrier proteins in deceased patients

前面的結(jié)論都是轉(zhuǎn)錄組的喊衫，為了從蛋白水平驗(yàn)證前面的結(jié)論， 作者對(duì)四個(gè)恢復(fù)患者和四個(gè)死亡患者的血漿進(jìn)行了蛋白組學(xué)檢測(cè)（包含不同時(shí)間點(diǎn)）杆怕。

Fig 7A-B：死亡患者和恢復(fù)患者相比族购，上調(diào)的蛋白和通路的clustering。提示死亡患者存在髓系通路的高度活化
Fig 7C：免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因熱圖陵珍。去世患者有更高水平的活化中性粒分泌的蛋白寝杖，包括NGAL, PRTN3, MMP9, MPO, TRFL和DEF1。這些中性粒分泌的蛋白主要是應(yīng)對(duì)病原誘導(dǎo)的感染下由TLR信號(hào)通路介導(dǎo)互纯。去世患者血漿中S100蛋白也更高瑟幕，它們是炎癥反應(yīng)的marker，參與TLR4表達(dá)的正反饋留潦≈豁铮恢復(fù)患者的高表達(dá)蛋白包括MARCO，一個(gè)巨噬細(xì)胞表達(dá)的清道夫受體 兔院，可以與循環(huán)PAMPs結(jié)合殖卑，活化TLR信號(hào)通路。這提示去世患者循環(huán)的PAMP結(jié)合和遞送到TLR在消耗MARCO坊萝。一些載脂蛋白apolipoproteins包括APOA1, APOA2, APOH, APOD和APOC4同樣是在恢復(fù)患者血漿中比較高孵稽。載脂蛋白可以作為PAMPs的載體活化TLR信號(hào)通路许起，介導(dǎo)抗病毒免疫。死亡患者外周血較低的MARCO和載脂蛋白水平與前面數(shù)據(jù)中轉(zhuǎn)錄水平較高的TLR活化相一致菩鲜，提示存在著這些蛋白的大量consuming园细。

Collectively, the COVID-19 ICU patient DAMP/PAMP TLR reporter cell activation studies, single-cell RNA sequencing, and proteomics analyses indicate that TLR hyperstimulation by nucleic acid-containing DAMPs/PAMPs can lead to excessive monocyte activation and con- sumption of immune modulators, all of which are associated with poor outcomes for COVID-19 ICU patients.

7. MnO-based nanoparticles mitigate TLR stimulation by COVID-19 ICU patient serum and ETA, and prevent DAMP/PAMP-mediated induction of TLR tolerance in monocytes

最后作者探究了DAMP/PAMP nanoscavenger是否可以限制這種單核細(xì)胞TLR過(guò)度活化和TLR耐受。
Fig3的結(jié)果提示核酸結(jié)合微纖維可以捕獲和中和DAMPs/PAMPs接校，所以作者想要去探究是否有一種可溶性納米顆撩推担可以拮抗新冠患者樣品中的DAMPs/PAMPs。用了MnO nanoparticles馅笙，結(jié)果顯示有效伦乔。（換了另一種生物材料...有湊圖嫌疑）

參考文獻(xiàn)：

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2. Circulating calprotectin as a biomarker of COVID-19 severity, Expet Rev. Clin. Immunol. 17 (5) (2021) 431–443.
3. CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance, Nat. Rev. Immunol. 8 (5) (2008) 362–371.
4. Constitutively expressed Siglec-9 inhibits LPS-induced CCR7, but enhances IL-4-induced CD200R expression in human macrophages, Biosci. Biotechnol. Biochem. 80 (6) (2016) 1141–1148.