1. A single-cell map for the transcriptomic signatures of peripheral blood mononuclear cells in end stage renal disease

這是今年剛發(fā)的一篇文章，影響因子5.991。因?yàn)槭亲鯬BMC的梭稚，來(lái)學(xué)習(xí)一下分析思路和亞群注釋的方法葡公。

背景：終末期腎衰存在systemic inflammation和immune deficiency，但背后機(jī)制未知措译。
方法和結(jié)果：對(duì)10個(gè)正常對(duì)照HC和10個(gè)終末期腎衰ESRD的PBMC樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序（是混樣送的扮叨，實(shí)際只送了兩個(gè)樣，真省錢）谢鹊。HC樣本得到12981個(gè)細(xì)胞，ESRD樣本得到9578個(gè)細(xì)胞留凭。分析結(jié)果顯示ESRD患者出現(xiàn)了免疫反應(yīng)佃扼、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞代謝的上調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程出現(xiàn)了下調(diào)蔼夜。此外兼耀，還鑒定了一些驅(qū)動(dòng)ESRD相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子。
結(jié)論：構(gòu)建了ESRD患者PBMC的high-resolution map（一個(gè)樣本求冷，九千多個(gè)細(xì)胞就敢說(shuō)是high-resolution map瘤运？），結(jié)果揭示了細(xì)胞群特異的通路和轉(zhuǎn)錄因子匠题。

這篇文章做的極為簡(jiǎn)單拯坟，F(xiàn)ig 1對(duì)所有細(xì)胞做了注釋，F(xiàn)eaturePlot看了一下marker基因韭山。Fig 2-4分別對(duì)單核細(xì)胞郁季、NK和B、T細(xì)胞做了GSVA通路富集(用的hallmark pathway gene)和SCENIC轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)钱磅。所用到的方法之前都寫(xiě)過(guò)梦裂，見(jiàn)：通路富集和SCENIC。通路富集結(jié)果和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果的解讀只要能自圓其說(shuō)即可盖淡。

重點(diǎn)來(lái)看下是怎么做的PBMC注釋吧

注釋了9個(gè)細(xì)胞亞群：

• 粒單系：樹(shù)突狀細(xì)胞 (Cluster 13; CD1C+)和單核細(xì)胞 (Clusters 5 和 8; CD68+年柠，Cluster 5: CD14+，高表達(dá)S100A8 和 S100A9褪迟，是經(jīng)典單核冗恨；Cluster 8 高表達(dá)FCGR3A/CD16，是非經(jīng)典單核)
• 巨核系：巨核細(xì)胞(PF4+)
• 淋系：
  T：(Clusters 0, 1, 3, 4, 9 and 11; CD3D+)
  B (Clusters 6 和 12; MS4A1+)
  NK (Clusters 2 和 7; CD3D- ,NKG7+)

T細(xì)胞還做了亞群細(xì)分（四個(gè)亞群）味赃，但是沒(méi)有按CD4和CD8來(lái)分派近。別的都是直接用的大群。
TEM/TEMRA 細(xì)胞 (effector memory or terminally differentiated effector memory T cells)：高表達(dá)細(xì)胞毒性分子(GNLY 和FGFBP2) 和其他效應(yīng)marker (CCL5, NKG7 和 KLRG1)
TN (naive T cells)：高表達(dá)CCR7和其他naive基因如LEF1
TCM (central memory T cells)：和TN一樣高表達(dá)IL7R, LEF1 和 CD27洁桌，但是和TN相比渴丸，低表達(dá)CCR7。高表達(dá)在TN中不表達(dá)的CCR6。
STMN1+T：高表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因STMN1谱轨，后續(xù)分析排除了這一群細(xì)胞戒幔。

附更全的T細(xì)胞marker參考表

2. Single-cell RNA sequencing reveals the sustained immune cell dysfunction in the pathogenesis of sepsis secondary to bacterial pneumonia

第二篇也是今年的文章，5.731分土童，做的繼發(fā)于細(xì)菌性肺炎的敗血癥患者外周血PBMC的單細(xì)胞測(cè)序诗茎。

Fig 1. 常規(guī)的圖譜展示

A：送樣流程。病例樣本來(lái)自兩個(gè)患者献汗，患者1 取了stable和recovery期兩個(gè)樣本（Sta-1和Rec-1）敢订。患者2取了stable罢吃，acute和recovery三個(gè)樣本（Sta-2, Acu-2和Rec-2）楚午。5個(gè)正常對(duì)照樣本中HC-1是作者自己送的，HC2-5來(lái)自于數(shù)據(jù)庫(kù)（是個(gè)省錢的辦法）尿招。一共測(cè)得了52412個(gè)細(xì)胞矾柜。
B和C：umap圖分別以細(xì)胞群和樣本來(lái)源著色。B圖的細(xì)胞注釋直接分了三個(gè)大群T/NK細(xì)胞 (CD3D+ IL32+ NKG7+)就谜，Myeloid細(xì)胞(CD14+ FCGR3A+ S100A9+)和B細(xì)胞(CD79B+ CD79A+ IGHM+)怪蔑。??這樣將NK和T放在一起注釋是可以理解的，因?yàn)榘吹览韥?lái)說(shuō)NK和T的區(qū)別在于T細(xì)胞是CD3(CD3D, CD3E等)陽(yáng)性的丧荐，而NK細(xì)胞是CD3陰性的缆瓣，但事實(shí)上很多細(xì)胞都是NKG7(NK marker)和CD3同時(shí)高表達(dá)，在E圖中也可以看出來(lái)虹统。
D：三個(gè)大群的通路富集弓坞。NK/T細(xì)胞主要富集到淋巴細(xì)胞活化和適應(yīng)性免疫反應(yīng)通路；髓系細(xì)胞主要富集到髓系白細(xì)胞活化窟却、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路和對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)通路；B細(xì)胞主要富集到B細(xì)胞活化和增殖通路呻逆。
E：marker基因展示
F：HC和病例組三個(gè)時(shí)期細(xì)胞群比例展示夸赫。NK/T細(xì)胞比例持續(xù)下降，髓系細(xì)胞比例持續(xù)上升咖城。提示免疫細(xì)胞比例失調(diào)在恢復(fù)期患者也持續(xù)存在茬腿。

Fig 2. 細(xì)菌性肺炎繼發(fā)敗血癥的病理生理過(guò)程中干擾素反應(yīng)和TNFA信號(hào)通路上調(diào)

因?yàn)闇y(cè)了時(shí)間點(diǎn)，所以這個(gè)fig主要是對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了分析（不管什么細(xì)胞宜雀，相當(dāng)于bulk RNAseq）切平。

A, B和C：急性期、穩(wěn)定期和恢復(fù)期分別和HC相比的差異基因的通路富集辐董。差異基因是用Seurat用的FindMarker()做的悴品，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：Adjusted p < 0.05 & |log2FC| > 0.25。隨后用fgsea(nperm = 1, minSize = 1, maxSize = 500)做的GSEA通路富集（significant hallmark gene sets）。P < 0.05的通路為顯著富集苔严。結(jié)果提示和HC相比定枷，病程三個(gè)時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)了IFN-r反應(yīng)的上調(diào)。此外急性期和恢復(fù)期還出現(xiàn)了NFkB介導(dǎo)的TNFa通路的上調(diào)届氢。
D圖：在ABC圖的基礎(chǔ)上查看了IFN-r反應(yīng)和NFkB介導(dǎo)的TNFa信號(hào)通路基因在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)欠窒，確實(shí)出現(xiàn)了上調(diào)。（這里NFkB介導(dǎo)的TNFa通路在三個(gè)時(shí)期都出現(xiàn)了上調(diào)）
E和F：為了探究這兩個(gè)在病程中持續(xù)存在的通路活化是哪種細(xì)胞介導(dǎo)的退子，做了三種免疫細(xì)胞群的GSEA通路富集岖妄。發(fā)現(xiàn)NK/T細(xì)胞在病程中所有階段都出現(xiàn)了IFN-r反應(yīng)上調(diào)，而髓系細(xì)胞在急性和恢復(fù)期出現(xiàn)了NFkB介導(dǎo)的TNFa信號(hào)通路反應(yīng)上調(diào)（和圖ABC對(duì)應(yīng)）

G圖：查看了疾病過(guò)程中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄變化寂祥，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)不同的時(shí)間依賴性表達(dá)模式荐虐，并評(píng)估了每個(gè)模式的功能。這部分是用TCseq做的壤靶。用法之前寫(xiě)過(guò)缚俏，見(jiàn)：TCseq：基因表達(dá)趨勢(shì)分析。

Fig 3. 細(xì)菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者的T細(xì)胞和NK細(xì)胞存在持續(xù)的耗竭和凋亡特征

A圖：對(duì)NK/T細(xì)胞進(jìn)行了亞群細(xì)分贮乳，得到了10個(gè)亞群忧换。
NK(FGFBP2+ NKG7+)
NKT(CD3D+ NCR3+)
Pro-T(MKI67+ STMN1+)
CD4T(CD3D+ CD4+): CD4 Tn(CD4+ CCR7+), CD4 Tpm(LTB+ IL7R+), CD4+CD28+T(CD4+ CD28+), Treg(IL2RA+ FOXP3+)
CD8T(CD3D+ CD8A+ CD8B+): CD8Tn(CD8A+ CCR7+), CD8Te(CCL5+ GZMB+), CD8Tem(GZMA+ GZMK+).

B圖：10個(gè)亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：10個(gè)亞群的功能富集
D圖：既往文獻(xiàn)報(bào)道sepsis患者的免疫抑制狀態(tài)主要與淋巴細(xì)胞尤其是T細(xì)胞的耗竭有關(guān)。所以D圖查看了T細(xì)胞耗竭(PRDM1和 LAG3)向拆、凋亡(TNFSF10, TNFRSF1B, BCL2L11 和CASP3)和激活(CD69)相關(guān)基因在三種細(xì)胞群中表達(dá)的點(diǎn)圖亚茬。結(jié)果顯示患者T細(xì)胞激活增強(qiáng)，除了CD4+CD28+T細(xì)胞以外浓恳，其他細(xì)胞耗竭和凋亡marker表達(dá)也增加刹缝。恢復(fù)期各種細(xì)胞也高表達(dá)耗竭和凋亡的marker，說(shuō)明雖然癥狀恢復(fù)了颈将，免疫細(xì)胞的紊亂并沒(méi)有恢復(fù)梢夯。（??可以借鑒）
??這個(gè)點(diǎn)圖的畫(huà)法可以通過(guò)將細(xì)胞類型和病程信息貼在一起存在一個(gè)新的metadata，再繪制點(diǎn)圖即可（堆疊點(diǎn)圖）晴圾。
E圖：不同病程時(shí)間點(diǎn)NK/T細(xì)胞亞群的比例變化颂砸。CD4+ Tn 和CD8+ Tn減少，提示免疫抑制死姚。CD8+ Te和CD8+ Tem增多人乓，提示淋巴細(xì)胞活性增強(qiáng)。CD8+ Te和CD8+Tem在急性期增加都毒，穩(wěn)定期下降色罚，恢復(fù)期再次增加。NK細(xì)胞在HC和急性期比例差不多账劲，穩(wěn)定期和恢復(fù)期持續(xù)增加戳护。
F圖：為了進(jìn)一步探究NK細(xì)胞功能金抡，提取了NK細(xì)胞，調(diào)整resolution進(jìn)行了再聚類姑尺。得到了兩個(gè)NK細(xì)胞群竟终。
G圖：兩個(gè)NK細(xì)胞群的功能富集
H圖：兩個(gè)NK細(xì)胞群比例變化

Fig 4. 髓系細(xì)胞的紊亂主要存在于恢復(fù)期

A圖：對(duì)髓系細(xì)胞群進(jìn)行了細(xì)分，得到8個(gè)亞群切蟋。
巨核細(xì)胞 (MK, PF4+ PPBP+)
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC, JCHAIN+ SEC11C+)
單核細(xì)胞(CD14+ /FCGR3A+)：CD14⁺ Mono1(CD14+ CPVL+), CD14⁺ Mono2 (S100A8+ VCAN+), CD16⁺ Mono (FCGR3A+ MS4A7+), HLA-DR⁺ Mono(HLA-DR+ CD74+), CD24⁺ Mono(CD24+ CAMP+) 和LDHB⁺ Mono(LDHB+ STMN1+) 统捶。
單核一般是按CD14和CD16來(lái)劃分的，后面幾個(gè)群是作者自己定義的柄粹。這些邊角小群定義起來(lái)很麻煩喘鸟，也有可能是雙細(xì)胞∽び遥總而言之什黑，單細(xì)胞亞群定義沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)則，言之有理即可堪夭。
B圖：8個(gè)亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：8個(gè)亞群的功能富集
D圖：8個(gè)亞群的比例變化愕把。CD24+Mono只在恢復(fù)期出現(xiàn)，作者認(rèn)為是一種新的細(xì)胞群
E圖：分析了一下和HC相比森爽，恢復(fù)期髓系細(xì)胞的通路富集恨豁，結(jié)果提示激活的免疫反應(yīng)在已經(jīng)恢復(fù)患者的髓系細(xì)胞中也存在。

Fig 5.細(xì)菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者外周血漿細(xì)胞出現(xiàn)擴(kuò)增

A圖：對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)分爬迟，得到3個(gè)亞群橘蜜。
Bn (TCL1A, IGHD 和 IL4R)
Bm (AIM2, TNFRSF13B 和 CD27)
漿細(xì)胞 (MZB1, IGHG3 和 JCHAIN)
這部分B細(xì)胞的注釋還結(jié)合了功能富集的結(jié)果
B圖：3個(gè)亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：3個(gè)亞群的功能富集（結(jié)合功能富集結(jié)果幫助細(xì)胞亞群注釋）
D圖：3個(gè)亞群的比例變化。漿細(xì)胞在急性期出現(xiàn)付呕，穩(wěn)定期進(jìn)一步增加计福，恢復(fù)期減少。
因此進(jìn)一步想要去探究漿細(xì)胞在急性期和穩(wěn)定期擴(kuò)增的機(jī)制
由于在前面NK細(xì)胞功能富集Fig3C中徽职，富集通路結(jié)果顯示NK細(xì)胞與B細(xì)胞增殖象颖，白細(xì)胞活化和正向調(diào)控凋亡反應(yīng)相關(guān)，所以想要進(jìn)一步去探究NK細(xì)胞和漿細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)系姆钉。（這個(gè)邏輯有點(diǎn)牽強(qiáng)）
E圖：HLA-DRA的表達(dá)和病程中漿細(xì)胞擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)變化相平行（说订？？牽強(qiáng)）
F圖：做了個(gè)細(xì)胞互作育韩，目的在于說(shuō)明NK細(xì)胞和B細(xì)胞的互作對(duì)漿細(xì)胞的擴(kuò)增很重要克蚂。（牽強(qiáng)）

Fig 6. 單核細(xì)胞可能通過(guò)IL1B信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)T細(xì)胞的擴(kuò)增和耗竭

細(xì)菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者的外周血T細(xì)胞呈現(xiàn)免疫活化和抑制的狀態(tài)闺鲸。既往文獻(xiàn)報(bào)道各種單核細(xì)胞亞群可能參與了T細(xì)胞的活化和凋亡筋讨，因此這部分使用NitchNetR分析了單核細(xì)胞和T細(xì)胞之間的互作。

研究活化：
挑選的sender細(xì)胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono, CD24+ Mono, HLA-DR+ Mono 和 LDHB+ Mono(Fig4C顯示這些細(xì)胞與T細(xì)胞活化高度相關(guān))
挑選的receiver細(xì)胞：CD8+ Te (A圖) 和 CD??8+ Tem (B圖) （這兩個(gè)細(xì)胞群在病程中比例持續(xù)增加）
A, B圖：結(jié)果顯示兩種活化相關(guān)的互作在恢復(fù)期比較集中摸恍，急性期則比較稀疏（急性期的圖在supplement）
C圖：top predicted ligand中悉罕，IL1B是所有挑選的sender單核細(xì)胞都表達(dá)的赤屋，對(duì)兩種receiver T細(xì)胞都起到調(diào)控作用。100A9, JUN 和 S100A8是IL1B對(duì)這兩種receiver T進(jìn)行調(diào)控的主要靶點(diǎn)壁袄。SPl1, RELA, FOS, EP300, STAT3, IRAK1 和 M??C等分子是IL1B對(duì)其靶基因進(jìn)行調(diào)控的transcriptional regulators类早。

研究抑制：
挑選的sender細(xì)胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono （Fig4C顯示這兩個(gè)細(xì)胞群功能與細(xì)胞死亡調(diào)控、凋亡嗜逻、負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)）
挑選的receiver細(xì)胞：CD4+ Tn (D圖) 和CD8+ Tn (E圖) （在病程中持續(xù)下降）
D, E圖：結(jié)果顯示這些sender細(xì)胞對(duì)CD4+ Tn的調(diào)控在急性期比較集中涩僻，而和CD8+ Tn的互作在各個(gè)時(shí)期均有發(fā)生。
F圖：top predicted ligand中栈顷，IL1B是所有挑選的sender單核細(xì)胞都表達(dá)的逆日，對(duì)兩種receiver T細(xì)胞都起到調(diào)控作用。并展示了其靶基因和中間regulator萄凤。

因此IL1B可以通過(guò)在不同時(shí)期作用于不同的靶基因參與到T細(xì)胞增殖和耗竭的調(diào)控

Fig 7. 細(xì)菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者和流感性肺炎室抽、SARS-CoV2肺炎繼發(fā)的敗血癥存在不同的免疫反應(yīng)

近期有研究顯示病毒和SARS-CoV2引起的敗血癥在器官功能失調(diào)、預(yù)后靡努、T細(xì)胞數(shù)目和亞型比例上均有區(qū)別坪圾，但是它們?cè)诿庖叻磻?yīng)上的區(qū)別并不明確。
因此作者從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了一組新冠引起的敗血癥性休克數(shù)據(jù)惑朦、一組新冠引起的多器官衰竭數(shù)據(jù)兽泄、一組繼發(fā)于流感性肺炎的敗血癥數(shù)據(jù)、一組細(xì)菌性肺炎繼發(fā)的敗血癥數(shù)據(jù)和作者自己的細(xì)菌性肺炎繼發(fā)的敗血癥數(shù)據(jù)行嗤，五組數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析已日。
A圖：一些干擾素相關(guān)基因在五組數(shù)據(jù)中的表達(dá)
B圖：五組數(shù)據(jù)細(xì)胞構(gòu)成差異
C圖：五組數(shù)據(jù)細(xì)胞比例變化
D圖：SARS和病毒性肺炎敗血癥相比IFNr通路富集情況
E圖：五組數(shù)據(jù)中T細(xì)胞亞群凋亡和耗竭相關(guān)基因的表達(dá)

這篇文章已經(jīng)做的比較全面了，思路還算清晰栅屏，分析數(shù)據(jù)量也很大飘千，只發(fā)了5分大概是因?yàn)橛腥税l(fā)的更早。
此外這片文獻(xiàn)的method里提到了用于Supervised cell type annotation的SciBet包栈雳，之前沒(méi)有用過(guò)护奈，查了一下是張澤民老師開(kāi)發(fā)的，值得學(xué)習(xí)哥纫。