文章題目：CRISPR/Cas9全基因組篩選在生命科學(xué)中的應(yīng)用
文章鏈接：http://www.lifescience.net.cn/html/201809/20180911.htm#outline_anchor_4
選文原因：補(bǔ)充了很多基礎(chǔ)知識(shí)點(diǎn)，把基礎(chǔ)多夯一夯哀澈，總是沒(méi)錯(cuò)的。
CRISPR/Cas9小知識(shí)點(diǎn)
- 其實(shí)做生信的人都會(huì)知道卖词，比對(duì)完成之后，挑選出CDS的gene吏夯，大約有2萬(wàn)多個(gè)坏平，那么文題中提到的全基因組篩選，其實(shí)大部分就是在說(shuō)這2W個(gè)gene锦亦。
- 常用的全基因組篩選方法（自認(rèn)為無(wú)法總結(jié)得更好，直接引用如下令境，做知識(shí)的搬運(yùn)工）：
此前杠园，常用的全基因組篩選方法由RNA干擾(RNA interfere, RNAi)和過(guò)表達(dá)cDNA文庫(kù)介導(dǎo)，結(jié)合高通量測(cè)序分析舔庶，獲得目的基因抛蚁。RNAi是指體外合成的短鏈RNA，如shRNA (short hairpin RNA)[4]惕橙、siRNA (small interfere RNA)[5]通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別瞧甩、降解mRNA，抑制基因翻譯弥鹦，導(dǎo)致基因功能性缺失(loss-of-function)[6-9]肚逸，該方法已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究[10-11]爷辙。但是，RNAi無(wú)法完全抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯朦促，并且容易脫靶導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[6, 12]膝晾。過(guò)表達(dá)cDNA是指將編碼基因的cDNA序列導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，提高蛋白質(zhì)的翻譯水平务冕，產(chǎn)生功能激活(gain-of-function)效應(yīng)血当。然而，真核生物基因轉(zhuǎn)錄后存在可變剪接禀忆，一個(gè)基因具有多種轉(zhuǎn)錄本臊旭，cDNA文庫(kù)難以完全覆蓋，只能揭示基因的部分功能[13-14]箩退。
- 溫故知新之CRISPR/Cas9原理
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由一個(gè)具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas9蛋白(或其他同源蛋白)和一條單鏈向?qū)NA (single guide, sgRNA)組成离熏。sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合靶向到基因組特定位點(diǎn)，Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks, DSB)乏德，經(jīng)過(guò)細(xì)胞自主性的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(homology- directed repair, HR)進(jìn)行修復(fù)撤奸，引入突變。NHEJ是一種錯(cuò)配的修復(fù)機(jī)制喊括，Ku70/80招募DNA連接酶IV到DSB位點(diǎn)胧瓜，DNA連接時(shí)產(chǎn)生堿基插入或缺失突變。HR是指有同源臂供體存在的情況下郑什，供體中的外源基因片段通過(guò)同源重組整合到靶位點(diǎn)府喳，利用這一方法可以實(shí)現(xiàn)基因的原位矯正[23]和遺傳增強(qiáng)[24]。已有研究表明蘑拯，在細(xì)胞分裂的各個(gè)時(shí)期中钝满，細(xì)胞自主發(fā)生NHEJ的頻率高于HR[25]，所以CRISPR/Cas9基因編輯常在靶位點(diǎn)產(chǎn)生堿基插入或缺失申窘，導(dǎo)致基因功能失活弯蚜。
這一段更加清晰明了的介紹了NHEJ和HR之間的不同，適合初學(xué)者補(bǔ)充背景知識(shí)剃法，也能更直觀的加強(qiáng)我對(duì)該系統(tǒng)的認(rèn)知碎捺。
-
核酸內(nèi)切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)
開(kāi)始涉足CRISPR/Cas9背景知識(shí)之后，會(huì)遇到很多不同名字的Cas9贷洲，例如收厨，iCas9，dCas9优构，CRISPRa诵叁，CRISPRi等等，了解他們之間的差別可以很大程度的擴(kuò)展對(duì)CRISPR/Cas9用途的理解钦椭，可謂一舉多得拧额。
dCas9：失活Cas9碑诉，即核酸內(nèi)切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)，能識(shí)別卻不會(huì)切割势腮。
（1）dCas9用于抑制基因表達(dá)
核酸內(nèi)切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)融合或招募轉(zhuǎn)錄因子联贩，作用在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites, TSS)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄捎拯。將dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子KRAB (Krüppel-associated box)融合泪幌，特異性地抑制基因表達(dá)(CRISPR interference, CRISPRi)[26-27]，干擾效率遠(yuǎn)高于RNAi署照。
(2) dCas9用于增強(qiáng)基因表達(dá)： dCas9可以將轉(zhuǎn)錄激活因子招募到TSS位點(diǎn)祸泪，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄激活(CRISPR activation, CRISPRa)[28]
①VPR系統(tǒng)，將dCas9與VP64建芙、p65激活結(jié)構(gòu)域(NF-κB的亞基)和Rta (Epstein-Barr病毒R反式激活因子)融合表達(dá)没隘，共同作用在TSS位點(diǎn)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[29]禁荸；
②Sun-Tag系統(tǒng)右蒲，dCas9融合10個(gè)串聯(lián)GCN4抗原，識(shí)別并結(jié)合scFv-sfGFP-VP64復(fù)合體赶熟，當(dāng)VP64被招募到TSS位點(diǎn)時(shí)瑰妄，基因轉(zhuǎn)錄被激活[30-31]；
③SAM系統(tǒng)(synergistic activation mediator)映砖，該系統(tǒng)由兩部分組成间坐，一部分表達(dá)dCas9-VP64復(fù)合體，并且轉(zhuǎn)錄sgRNA-MS2-hairpin (hairpin可識(shí)別并結(jié)合MS2)邑退，另一部分表達(dá)MS2-p65-HSF1 (MPH v2, HSF1: human heat-shock factor 1)復(fù)合體竹宋，該復(fù)合體被MS2-hairpin招募到TSS位點(diǎn)，與VP64組成協(xié)同激活中間體(SAM)地技，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[32]蜈七。事實(shí)上，這一段才是我看這篇文章的主要目的莫矗，主要是在閱讀文獻(xiàn)的過(guò)程中飒硅，發(fā)現(xiàn)有不明白的地方，因此回頭補(bǔ)充基礎(chǔ)知識(shí)趣苏，由此可知，這篇文章使用了dCas9的SAM系統(tǒng)促進(jìn)基因表達(dá)梯轻，主要功臣為VP64反式激活結(jié)構(gòu)域食磕。
image.png
5. 全基因組篩選工具：基于CRISPR/Cas9的library工具
敲重點(diǎn)
當(dāng)sgRNA靶向單基因時(shí)，CRISPR可視為一種高效的基因編輯工具喳挑。但當(dāng)sgRNA靶向全基因組序列時(shí)彬伦，CRISPR便升級(jí)為一種全基因組篩選的工具滔悉。基于CRISPR/Cas9篩選的一般流程如下(圖 1)：
①構(gòu)建靶向全基因組的基因敲除文庫(kù)(genome-scale CRISPR-Cas9 knockout, GeCKO)或激活基因sgRNA文庫(kù)单绑；
②包裝慢病毒文庫(kù)回官；
③以低MOI (multiplicity of infection，通常為0.3)感染細(xì)胞搂橙，使sgRNA整合到細(xì)胞基因組上歉提，隨基因組DNA的復(fù)制而復(fù)制；
④用抗生素篩選出感染病毒的細(xì)胞区转；
⑤根據(jù)表型(耐藥性苔巨、增殖能力、存活能力废离、標(biāo)記基因等)選擇細(xì)胞侄泽；
⑥提取細(xì)胞核基因組；
⑦建庫(kù)蜻韭，進(jìn)行二代測(cè)序悼尾；
⑧利用生物信息學(xué)分析獲得目的基因[33-34]。
好了肖方，今天就暫時(shí)到這兒吧闺魏，拜拜。
