陸軍軍醫(yī)大學(xué)在Molecular Cancer（IF=41.444）雜志上發(fā)表了題為“Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification”的研究性論文，該研究建立了一個ALKBH5-PKMYT1-IGF2BP3的轉(zhuǎn)移調(diào)控系統(tǒng)亭罪，為胃癌轉(zhuǎn)移提供了一個新的治療靶點瘦馍。諾禾致源在此承擔(dān)m6A的測序工作。
研究背景
研究表明应役，胃癌（gastric carcinoma情组，以下簡稱GC）的表觀遺傳變化與其侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[1-2]。已有研究報道：m6A修飾參與包括GC在內(nèi)的各種腫瘤的腫瘤進展過程[3-5]箩祥，在GC研究中院崇，大多數(shù)主要從甲基轉(zhuǎn)移酶的角度研究了胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制[6-8], 但對去甲基酶參與胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子機制尚未完全闡明。
研究思路
研究內(nèi)容
1.MeRIP-seq：m6A修飾的基因與GC細(xì)胞粘附有很強的相關(guān)性袍祖；去甲基化酶ALKBH5下調(diào)與GC預(yù)后相關(guān)
GC組織的MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)m6A信號主要出現(xiàn)在mRNA轉(zhuǎn)錄本的終止密碼子和3'UTR附近（Peak在mRNA轉(zhuǎn)錄本功能區(qū)域上的分布）底瓣，m6A修飾集中在GGACU基序上（Motif分析）。大多數(shù)在GC組織中表現(xiàn)出較高水平的m6A修飾（差異分析）蕉陋，GO分析表明這些基因主要富集在細(xì)胞-細(xì)胞粘附和上皮細(xì)胞遷移中（功能富集分析）捐凭。與此同時，這些基因的mRNA水平也明顯高于鄰近正常組織凳鬓。（MeRIP-seq與mRNA關(guān)聯(lián)分析）茁肠。（上述分析內(nèi)容諾禾致源均可實現(xiàn)）
利用TCGA數(shù)據(jù)庫（研究m6A 相關(guān)酶和遷移相關(guān)基因之間的相關(guān)性）、結(jié)合mRNA-seq數(shù)據(jù)以及對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)缩举，發(fā)現(xiàn)ALKBH5在胃癌組織中表達明顯降低垦梆，且與臨床腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明ALKBH5的低表達可能是胃癌轉(zhuǎn)移的根源仅孩，可能是參與細(xì)胞遷移的關(guān)鍵去甲基化酶托猩。
2.ALKBH5體外功能研究：在體外抑制GC的侵襲和遷移
Transwell實驗及傷口愈合實驗發(fā)現(xiàn)過表達ALKBH5顯著抑制了GC細(xì)胞的遷移能力，而干擾ALKBH5表達促進了GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移辽慕，進一步闡明m6A 去甲基化酶ALKBH5在細(xì)胞遷移中的作用京腥，且這種作用與ALKBH5的去甲基酶活性密切相關(guān)。
3.ALKBH5下游靶標(biāo)基因的鑒定：PKMYT1
構(gòu)建ALKBH5過表達細(xì)胞系溅蛉，通過RNA-seq鑒定ALKBH5在GC轉(zhuǎn)移過程中的潛在靶基因绞旅。在ALKBH5過表達細(xì)胞系中大部分與粘性相關(guān)的基因下調(diào)；結(jié)合MeRIP-seq篩選的GC組織中m6A水平上調(diào)的基因温艇，共篩選出237個共有基因因悲。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫篩選GC組織中表達量上調(diào)的基因，結(jié)合已有文獻以及MeRIP-qRT-PCR勺爱，最終篩選出ALKBH5的靶標(biāo)基因PKMYT1（磷酸化蛋白激酶）晃琳。在SGC-7901細(xì)胞中，干擾ALKBH5 使PKMYT1的m6A修飾水平和表達水平增加；過表達ALKBH5使PKMYT1的表達水平下降卫旱。RIP-seq和RNA pull down實驗證明PKMYT1的轉(zhuǎn)錄本能夠與ALKBH5結(jié)合人灼。另外，組織微陣列（TMA）和TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)也證明GC組織中PKMYT1高表達顾翼，且與不良預(yù)后密切相關(guān)投放；細(xì)胞侵襲實驗證明過表達/抑制PKMYT1可增強/減弱了GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，且過表達PKMYT1恢復(fù)了由于過表達ALKBH5導(dǎo)致的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的減弱适贸，反之亦然灸芳。因此，PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點拜姿，可以促進GC的侵襲和遷移烙样。
4.PKMYT1功能探究：以m6A依賴的方式促進GC的侵襲和遷移
使用SRAMP網(wǎng)站預(yù)測PKMYT1的mRNA序列中具有非常高置信度的五個潛在m6A修飾位點并利用MeRIP-qPCR進行驗證，結(jié)果表明：與正常組織相比蕊肥，GC組織中兩個位點的m6A修飾水平顯著升高谒获，過表達ALKBH5導(dǎo)致這兩個位點m6A水平顯著降低，而當(dāng)ALKBH5脫甲基化酶活性的殘基突變后它們的m6A水平得到恢復(fù)壁却。敲除ALKBH5后觀察到相反的結(jié)果批狱。由此表明PKMYT1 mRNA上的兩個位點可能是ALKBH5調(diào)控的特定位點。GC組織的MeRIP-seq測序中IGV分析表明:與正常組織相比展东，GC中這兩個位點的m6A修飾水平明顯更高赔硫；此外，PKMYT1在ALKBH5 H204A中明顯下調(diào)琅锻。對兩位點進行突變卦停，突變后PKMYT1整體表達水平降低向胡，GC轉(zhuǎn)移能力顯著降低恼蓬。這種現(xiàn)象在ALKBH5敲低后更為明顯。因此僵芹，研究認(rèn)為PKMYT1以m6A依賴的方式促進GC的入侵和遷移处硬。
5.m6A閱讀蛋白IGF2BP3通過其m6A修飾位點幫助維持PKMYT1 mRNA的穩(wěn)定性
RNA pulldown實驗和質(zhì)譜分析確定了PKMYT1 m6A 修飾中潛在的閱讀蛋白IGF2BP3（胰島素樣生長因子II mRNA結(jié)合蛋白3），結(jié)合RIP-seq拇派、組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫分析驗證發(fā)現(xiàn)IGF2BP3和PKMYT1在GC中的表達顯著正相關(guān)荷辕，干擾IGF2BP3后，PKMYT1的表達顯著降低件豌。體外轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn)IGF2BP3與PKMYT1 mRNA的結(jié)合能力在兩個PKMYT1 m6A 修飾位點突變后明顯下降疮方，表明IGF2BP3在維持PKMYT1 mRNA穩(wěn)定性上的作用。
6.體內(nèi)ALKBH5茧彤、PKMYT1與IGF2BP3的相關(guān)性研究
通過組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫分析腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中PKMYT1和IGF2BP3的表達情況：轉(zhuǎn)移組IGF2BP3和PKMYT1表達明顯高于未轉(zhuǎn)移組骡显；構(gòu)建的裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)過表達ALKBH5使細(xì)胞形成肺轉(zhuǎn)移的能力降低，肺組織切片HE染色顯示轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少惫谤，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKMYT1表達明顯受到抑制壁顶。敲除ALKBH5后觀察到相反的結(jié)果。
結(jié)論
研究確定ALKBH5是胃癌轉(zhuǎn)移的腫瘤抑制因子溜歪，并且這種作用依賴于ALKBH5的去甲基化酶活性若专。PKMYT1是ALKBH5的下游靶基因且與ALKBH5表達呈負(fù)相關(guān)；PKMYT1經(jīng)過m6A修飾后蝴猪，蛋白IGF2BP3通過識別其 m6A 修飾位點幫助增強 PKMYT1 的 mRNA 穩(wěn)定性调衰，導(dǎo)致其更高的表達水平，最終促進胃癌轉(zhuǎn)移拯腮。
