從事生物試劑公司的技術(shù)崗已有多年，常常會(huì)收到來自客戶各種問題的反饋兵扬，其中關(guān)于siRNA轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品麻裳，問的最多的就是“為什么我做出來的結(jié)果沒有你們說的好？”器钟。這是一個(gè)不太好回答的問題津坑。實(shí)際上，主要原因還是客戶操作的問題傲霸。比如疆瑰，實(shí)驗(yàn)條件沒有充分優(yōu)化、沒有按照說明書要求操作昙啄、實(shí)驗(yàn)操作不夠熟練細(xì)心穆役，等等。下面我們就結(jié)合幾個(gè)具體的客戶案例來分析一下梳凛，希望對(duì)同學(xué)們有所幫助耿币。
案例一：上海某醫(yī)學(xué)院研究生使用RFect V2轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，反饋目的基因siRNA敲低效果不夠理想韧拒，求助解決方案淹接。
案例詳情：客戶購買之前，通過SCI文獻(xiàn)了解到RFect V2能在SW480細(xì)胞中做到90%以上的敲降效果叛溢，因此自己做不出來時(shí)便產(chǎn)生了懷疑蹈集。在收到該反饋后，我們隨即讓客戶詳細(xì)填寫了《siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)溝通信息表》雇初。根據(jù)所填內(nèi)容我們發(fā)現(xiàn)了其中的關(guān)鍵問題--客戶沒有按照Rfect V2的說明書進(jìn)行操作，而是表面上使用了Rfect V2轉(zhuǎn)染試劑减响，在實(shí)際操作上卻使用了之前用過的lipo3000的轉(zhuǎn)染方案：如在轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基靖诗、轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到了80%郭怪、配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)沒有使用Rfect V2試劑盒內(nèi)的Trans Enhencer而是Opti-MEM、轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換了新鮮培養(yǎng)基刊橘。不太明白客戶當(dāng)時(shí)的心態(tài)鄙才，但這樣的操作不僅增加了實(shí)驗(yàn)的麻煩實(shí)際上又降低了轉(zhuǎn)染效率。我們跟該研究者進(jìn)行了詳細(xì)溝通促绵，委婉地指出了存在的問題并提出了改進(jìn)建議攒庵。一周后，我們收到了他的好消息败晴，改進(jìn)后目的基因的敲除效率達(dá)到了93%浓冒，下面是客戶反饋的熒光圖（圖1）。
圖1. 上海研究者提供的RFect V2轉(zhuǎn)染FAM-NC到SW480細(xì)胞熒光圖尖坤。
上述這個(gè)案例非常典型稳懒，有相當(dāng)一部分客戶都會(huì)存在這樣的問題。為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象慢味，我們推測(cè)场梆，可能有以下原因：1、過于相信國外品牌的性能纯路，但實(shí)際上對(duì)于siRNA轉(zhuǎn)染試劑來說或油，國內(nèi)品牌特別是Rfect V2 siRNA轉(zhuǎn)染試劑的性能經(jīng)過客戶多年使用，已充分證明其性能已達(dá)到或超過國外某些權(quán)威品牌的性能驰唬。如果客戶要比較兩者的優(yōu)劣顶岸，也應(yīng)該按各自的說明書嚴(yán)格操作，不能使用了一家的轉(zhuǎn)染試劑定嗓，卻按照另一家的流程去操作蜕琴。2、操作習(xí)慣的問題宵溅，有些客戶過去經(jīng)常使用Lipo3000或RNAiMAX進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染凌简，因而已經(jīng)形成了轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換液的習(xí)慣，形成了配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物要使用Opti-MEM的習(xí)慣恃逻，在換用Rfect V2 轉(zhuǎn)染試劑時(shí)雏搂，操作思路沒有及時(shí)切換。他們沒有意識(shí)到寇损，使用國產(chǎn)Rfect V2根本不需要如此繁瑣的操作就可以取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果凸郑。
主要問題：未按說明書要求認(rèn)真進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，混用其他試劑的轉(zhuǎn)染方案矛市。
啟示：不要根據(jù)過去的習(xí)慣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)芙沥，要認(rèn)真閱讀說明書，嚴(yán)格按照每種試劑的操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
案例二：武漢某高校研究生使用RFect V2轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2而昨，反饋轉(zhuǎn)染NC-FAM后顯微鏡下看不到熒光點(diǎn)救氯，認(rèn)為沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去。
案例詳情：根據(jù)客戶反饋的熒光圖來看歌憨，熒光背景非常強(qiáng)（呈現(xiàn)較刺眼的綠色背景）着憨，和正常的熒光圖背景相比差別較大，顯然在觀察熒光前沒有使用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行背景洗滌务嫡，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的siRNA熒光由于受細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)遮蔽因而普遍弱于細(xì)胞外的熒光強(qiáng)度甲抖，致使觀察時(shí)無法辨認(rèn)清晰而產(chǎn)生未轉(zhuǎn)染進(jìn)去的誤判。并且心铃，如果不進(jìn)行清洗准谚，細(xì)胞表面會(huì)吸附熒光標(biāo)記的siRNA和細(xì)小的熒光顆粒，有時(shí)又會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)染陽性判斷于个。經(jīng)此溝通氛魁，客戶聽取并接受了建議，在用PBS洗滌兩次后重新進(jìn)行熒光觀察厅篓，獲得了和此前截然不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）秀存。
主要問題：未進(jìn)行背景洗滌后觀察熒光效果，導(dǎo)致誤判羽氮。
啟示：熒光背景很強(qiáng)的情況下或链，不利于觀察siRNA轉(zhuǎn)染陽性率，建議使用PBS洗滌后觀察档押。
圖2.RFect V2轉(zhuǎn)染FAM-NC到HepG2細(xì)胞澳盐，24h熒光圖。
案例三：北京高校某醫(yī)學(xué)院博士使用RFect V2轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞Hela令宿，反饋和lipofectamine3000轉(zhuǎn)染的熒光圖對(duì)比叼耙，lipofectamine3000轉(zhuǎn)染出來的熒光更加明亮，但目的基因的敲除效率只有76%粒没，RFect V2的熒光較弱筛婉，但目的基因的敲除效率卻有92%，他感到比較困惑癞松。
案例詳情：我們認(rèn)真看了客戶的熒光圖爽撒，兩款試劑的轉(zhuǎn)染陽性率均達(dá)到了90%以上，但顯然lipofectamine3000的熒光更加明亮响蓉。同類問題也有一些其他高校的同學(xué)問過硕勿，我們實(shí)驗(yàn)室也做過比對(duì)研究。造成該現(xiàn)象的主要原因在于兩款試劑的成分不同枫甲，因而轉(zhuǎn)染后所呈現(xiàn)出來熒光效果有所差異源武。Lipofectamine3000主要為陽離子脂質(zhì)體成分扼褪，這種成分不易降解且具有較高的電荷強(qiáng)度，更適合于質(zhì)粒這種大分子的胞內(nèi)遞送粱栖，而對(duì)于siRNA這類小核酸來說迎捺，其高強(qiáng)度電荷會(huì)將很多siRNA緊密吸附，出現(xiàn)不易使siRNA在胞內(nèi)充分釋放的情況查排。因此研究者在轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)記的siRNA時(shí)，由于熒光在細(xì)胞內(nèi)聚團(tuán)得不到及時(shí)釋放抄沮，觀察的時(shí)候熒光效果就看起來非常明亮跋核，但由于siRNA沒有充分釋放，目的基因的敲除效率就不盡理想叛买。不同的是砂代，RFect V2是以可降解生物納米材料研發(fā)的，是專業(yè)轉(zhuǎn)染小核酸的轉(zhuǎn)染試劑率挣，在轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入細(xì)胞后刻伊，試劑自身會(huì)很快降解從而快速充分地釋放出siRNA，但siRNA本身就是小片段椒功，因此釋放到細(xì)胞質(zhì)中的時(shí)候捶箱，我們?cè)跓晒怙@微鏡下觀察到的就是有些折光、分散于細(xì)胞質(zhì)的點(diǎn)狀熒光动漾，這也就是為什么RFect V2的熒光看起來較弱而目的基因敲除效率卻很高的原因丁屎。這提示我們，生物科研實(shí)驗(yàn)的邏輯關(guān)系比較復(fù)雜旱眯，不能只考慮量效關(guān)系這種比較表層的邏輯晨川，還要考慮更深層次的影響因素和邏輯分流現(xiàn)象。
主要問題：認(rèn)為可以通過siRNA轉(zhuǎn)染的熒光強(qiáng)弱來判斷轉(zhuǎn)染效率删豺。
啟示：熒光強(qiáng)往往意味著帶熒光標(biāo)記的siRNA聚團(tuán)而未得到有效釋放共虑，因而目的基因的siRNA也極大可能無法被充分釋放出來發(fā)揮敲降作用，只有通過RT-qPCR檢測(cè)目的基因的沉默效率才是判斷siRNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率的金標(biāo)準(zhǔn)呀页。
