直接計數(shù)法
“貼壁”細胞計數(shù):這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后李滴,可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去≡俚浚可以通過給細胞染色缎除,可在鏡下計數(shù)細胞
* 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞;
* 染色:常用的染色方法有結(jié)晶紫染色荒辕、臺靡藍染色汗销、Giemsa染色、蘇木精染色抵窒、伊紅染色等弛针。
* 細胞計數(shù):使用正置顯微鏡進行觀察和拍照,把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細胞估脆。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色钦奋,再貼在玻片上,滴二甲苯疙赠,再蓋上蓋玻片付材,就可以長期保存,但是這樣做小室就成了一次性的了圃阳,未免有點浪費厌衔。(取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)。一般采用3-5個視野捍岳,也有人用10個富寿,都是隨機選取。)
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間接計數(shù)法
由于某些細胞自身的原因或某些膜的關(guān)系锣夹,有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上页徐,而是掉進下室。 間接計數(shù)法主要用于穿過細胞過多银萍,而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法变勇,與常用的MTT實驗是同樣的原理。
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- MTT法
用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞贴唇;
24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基搀绣,將 小室置于其中,使膜浸沒在培養(yǎng)基中戳气,37℃ 4h后取出链患。
24孔板中加入500μl DMSO,將小室置于其中瓶您,使膜浸沒在DMSO中麻捻,振蕩10min纲仍,使甲湃充分溶解。取出小室贸毕,24孔板于酶標儀上測OD值巷折。
- 熒光試劑檢測 這類方法一般是與Transwell小室一起出售的,其原理與MTT法類似崖咨,是用一種熒光染料染細胞,再將細胞裂解油吭,檢測熒光值击蹲。Chemicon的ECM554即屬于這類。
- 結(jié)晶紫檢測 上文已說過婉宰,這里不再贅述歌豺,原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個優(yōu)點心包,就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞类咧,在脫色后還可重新染色。
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