作者：Arno
審稿：童蒙
編輯：Amethyst
基因組代表了遺傳研究的起點溢吻。自從發(fā)現(xiàn)DNA結構以來展箱，科學家們一直致力于以精確的方式確定堿基的排列順序沼溜。從1965年開始第一個酵母的片段測序到現(xiàn)在漏麦，測序的讀長依然不足以覆蓋大多數(shù)物種整個基因組的大小，因此基因組組裝技術也一直是不斷研發(fā)改進的關鍵技術艘策。本文系統(tǒng)的回顧了整個基因組測序相關的重要技術蹈胡、主要里程碑以及當前三代測序技術的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。
基因組測序回顧
下圖展示了基因組組裝的各個重要的里程碑朋蔫。不同的顏色背景分別展示了從最早基于核苷酸的早期測序到基于Sanger的鳥槍法測序罚渐，到大規(guī)模的二代NGS測序，再到現(xiàn)在的三代TGS測序的主要組裝成就驯妄。歷時13年（1990-2003）耗資30億美元的人類基因組計劃（HGP）毫無疑問加速了基因組組裝的進程荷并，NGS衍生了一系列新穎的應用，包括全外顯子組測序青扔、RNA-seq源织、ChIp-seq、WGBS-seq等等微猖，極大的促進了基因組測序的應用谈息。2010年之后，全新的技術開啟了第三代測序TGS—長讀長測序的時代凛剥，長讀長測序極大的增加了基因組組裝的優(yōu)勢侠仇，基因組組裝的連續(xù)性大大提高。
三代測序技術及組裝
1.三代測序技術及優(yōu)勢
TGS的定義可能會有所不同，通常是指無需擴增直接對單個DNA分子進行測序的技術逻炊。這些技術產(chǎn)生比NGS更長的reads互亮，每個reads可以跨越幾到幾百kbps的長度。10X Genomics linked reads 以及Hi-C等NGS的技術可以使得基因組組裝連續(xù)度有一定的提升余素，但是TGS的出現(xiàn)豹休，使得組裝連續(xù)度的提升變得更加容易。
目前應用比較多的三代測序技術溺森，一種是Pacific Biosciences(PaciBio)公司完善和商業(yè)化的單分子實時測序技術（SMRT）,另一種是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司商業(yè)化的納米孔測序技術（Nanopore）慕爬。SMRT測序技術應用了邊合成邊測序的原理，以SMRT芯片為測序載體屏积，載體上分布上百萬個納米級的零模波導孔（ZMW），每個ZMW中聚合酶捕獲文庫DNA序列磅甩，通過熒光激發(fā)dNTP炊林，從而根據(jù)捕獲熒光信號的長短，進行邊合成邊測序卷要。目前SMRT測序有兩種模式渣聚，一種是Continuous Long Read（CLR）模式，一種是Circular Consensus Sequences（CCS）模式僧叉。CLR的讀長更長奕枝，但是堿基測序的錯誤率較高（準確率90%遠低于NGS的99.9%），但是測序錯誤是完全隨機的瓶堕，CCS模式即利用這種特性隘道，通過自我校正的方法將測序的錯誤率降低到了NGS的水平，與此同時相比CLR犧牲了測序讀長郎笆。
納米孔測序使用插入人工脂質雙層的轉基因細菌納米孔谭梗，放置在幾十微米寬的單個微孔中并排列在傳感器芯片上， 當每條單鏈 DNA 穿過一個通道時宛蚓，它會擾亂流過孔的電流激捏，并由半導體傳感器測量變化。不同的堿基以略微不同的方式破壞電場凄吏，記錄的電流變化可以轉化為 DNA 序列远舅。ONT可以讀取的長度更長，取決于制備的DNA文庫的大小痕钢，但是其堿基的準確率難以校正图柏，測序的錯誤率也較高。
三代測序技術盖喷，由于其超長的讀長爆办，可以有效的跨越基因組中復雜的區(qū)域，從而顯著提高基因組組裝的質量课梳。此外距辆，在二倍體（多倍體）基因組中余佃，TGS可以更容易的生成單倍型的長定相塊，區(qū)分來源于父母本的遺傳信息跨算，避免嵌合的基因組爆土，有助于準確的進行包括高度重復區(qū)域的長變異、大型的插入缺失诸蚕、重復步势、倒位和易位等結構變異（SV）檢測。同時三代測序還可以通過PacBio的酶動力學反應或Nanopore中的離子電流信號來實現(xiàn)表觀遺傳的測序背犯。
2.三代測序組裝軟件
FALCON是PacBio直接開發(fā)并于2013年發(fā)布的基于三代數(shù)據(jù)的De novo組裝軟件坏瘩，它繼承于分級基因組裝配（HGAP）流程，首先進行序列自身的比對漠魏，以校正三代測序的reads準確度倔矾，然后使用de Brujin圖（DBG）構建重疊群，如下圖所示柱锹。FALCON可以識別二倍體序列哪自，可以輸出包含位點變異信息的等位基因序列（alternative contigs / a-contigs）和主要的基因組序列（primary contig / p-contig）。FALCON-Unzip是FALCON的升級版禁熏，可以利用初始組裝中鑒定的雜合SNP來獲得高度定相的單倍型壤巷，再利用Hi-C數(shù)據(jù)映射到組裝中，利用haplotigs和共有序列瞧毙，將兩個單倍體完全組裝出來胧华。
Canu是起源于Celera Assember的三代組裝軟件，可以用于PacBio和Nanopore兩家公司得到的測序結果升筏，其采用Overlap-Layout-Consensus（OLC）的方式進行組裝撑柔，即利用長序列與序列之間的交疊進行組裝，主要分為糾錯您访、修剪和組裝三大步铅忿。對于FALCON來說，雖然經(jīng)過組裝之前的糾錯灵汪，相比短讀長有比較大的改進檀训，但其組裝出來的單倍型仍然是嵌合的，重復序列經(jīng)常被折疊到一個序列中享言，為了解決這個問題峻凫，2018年發(fā)布的新版本的軟件TrioCanu可以利用親本信息來完全定相單倍型，其利用父母本的二代illumina數(shù)據(jù)在組裝之前根據(jù)不同的SNP對組裝樣本的序列進行分類览露，然后進行獨立組裝出兩套來源于親本的單倍型荧琼，因此TrioCanu尤其適合于高雜合的基因組組裝。
Canu的計算是比較慢的，HiFiasm是近兩年開發(fā)的一個用于PacBio HiFi reads的快速單倍型解析從頭組裝軟件命锄，它可以在單個機器上多線程運行堰乔，在較少的資源消耗下快速完成基因組的組裝，同時也可以在給定親本數(shù)據(jù)的情況下脐恩，實現(xiàn)子代來自不同親本的單倍體組裝镐侯。但是其單倍型分型的準確性略差于TrioCanu。
組裝結果的準確性驶冒，計算工作的優(yōu)化都是組裝需要考慮的方面苟翻，目前已開發(fā)出多種從頭組裝的軟件，除以上介紹的軟件外骗污，還有Wtdbg2崇猫、Flye、Peregrine需忿、Shasta等等邓尤，這幾個軟件的速度都比較快，但是其組裝質量可能沒那么準確贴谎。所有的基因組組裝方法和軟件都有優(yōu)點和缺點，實際應用中可以考慮實際組裝物種的情況季稳，以及測序策略擅这、組裝目標，綜合考量選取準確優(yōu)秀的組裝軟件景鼠。
基因組組裝掛載
對于大基因組來說仲翎，即便長讀長的reads也不能跨越整條染色體序列，需要其它連鎖信息來定位和排序組裝的重疊群铛漓，以將基因組組裝提升到支架（Scanfold）水平溯香。Bionano光學圖譜是一種單分子DNA技術，該方法基于DNA標記浓恶，生成遺傳光學圖譜玫坛，然后結合初始組裝的重疊群，可以進一步對重疊群進行定相和排序包晰，產(chǎn)生更長的支架湿镀。除此之外，Bionano光學圖譜還可以用于SV和甲基化的分析伐憾。
另外一種定向和排序重疊群的技術是基于染色體構象捕獲（3C）的技術（Hi-C）勉痴。Hi-C技術首先使用甲醛將染色體空間構象固定之后，再利用限制性內切酶處理DNA树肃，并重新連接空間上臨近的DNA分子蒸矛，該技術利用基因組的空間信息，組合重疊群以及支架將其分配到染色體水平。Hi-C目前是在大基因組中實現(xiàn)染色體水平支架的唯一方法雏掠，但往往不如Bionano支架那么保守斩祭，染色質不可預測的折疊導致染色體遠處區(qū)域的相互作用，可能導致組裝錯誤磁玉，例如人工倒位停忿、同一染色體內的支架錯位或不同染色體的支架錯配。綜合利用不同的技術可以更好地糾正這些錯誤蚊伞，甚至可以獲得整個染色體的端粒到端粒組裝 席赂。
總結
基因組組裝的方式一直在不斷創(chuàng)新、優(yōu)化时迫。通過不斷改進現(xiàn)有技術并引入全新的 DNA 測序方法和生物信息學工具颅停，組裝的質量一直在提升。NGS 引入的高通量能力和 TGS 提供的更高質量序列掠拳，最終使復雜的基因組也可用于全基因組研究癞揉。人類遺傳學研究，包括人口基因組學溺欧、遺傳疾病定位和診斷喊熟、個性化醫(yī)療計劃、癌癥研究和產(chǎn)前檢測姐刁，已經(jīng)受益于過去十年基因組測序和組裝的進步芥牌。同樣，這些方法越來越多地用于非模式生物以了解生態(tài)和進化過程聂使。對參考基因組測序和組裝的承諾現(xiàn)已從單一物種項目擴大到多物種協(xié)調工作壁拉，旨在使用 NGS 和 TGS 方法組合為大多數(shù)生物體產(chǎn)生高質量基因組的項目目前正在進行中。
參考文獻
Giani AM, Gallo GR, Gianfranceschi L, Formenti G. Long walk to genomics: History and current approaches to genome sequencing and assembly. Comput Struct Biotechnol J. 2019 Nov 17;18:9-19. doi: 10.1016/j.csbj.2019.11.002. PMID: 31890139; PMCID: PMC6926122.
