Author: Junfei Xie
Date: 09-10-2021
組織解剖及預(yù)處理：
實蠅冰上麻醉依溯，放入75%酒精中消毒3分鐘，然后轉(zhuǎn)入PBS清洗温算；
清洗干凈的果蠅放入盛放Grace's Insect Medium培養(yǎng)皿中胆绊，小心解剖出需要的組織；
組織轉(zhuǎn)移入4%多聚甲醛PFA中颜屠，室溫固定1h;
用800ul PBTT在室溫通透化處理15min辰妙；
PBTT洗滌三次，每次5min甫窟；
PBS洗滌樣品兩次密浑，每次5min;
用PBT：RNA雜交液=1：1，洗滌一次蕴坪，然后樣品儲存在RNA雜交液中肴掷。
預(yù)雜交
RNA雜交液煮沸5分鐘，冰上驟冷5分鐘背传；
樣品加入雜交液中呆瞻，56℃孵育2h;
雜交
探針用RNA雜交液稀釋，比例1：50——1：2000径玖；
加熱探針80℃痴脾，5min，冰上驟冷5min梳星；（對于短探針<50nt赞赖，無復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)則無需此步驟）
樣本加入探針雜交液中滚朵，56℃雜交12h（短探針30nt-80nt，孵育時間30min-2h）
樣品轉(zhuǎn)移至DAPI染色液中孵育30min前域；
洗滌
預(yù)熱雜交液至56℃辕近，洗滌樣品3次，每次15min;
用PBT洗滌5min;
轉(zhuǎn)移入PBS中洗滌5分鐘匿垄；
制片
避光保存的樣品轉(zhuǎn)移至體式熒光顯微鏡下移宅，
在載玻片中央滴加一滴抗淬滅劑，樣品放入淬滅劑椿疗，并解剖脂肪體至細小碎塊漏峰，分散開來。
用蓋玻片從一端慢慢下壓届榄，完全覆蓋在樣品上浅乔，切勿左右移動蓋玻片。
吸取多余淬滅劑铝条，并用指甲油封閉玻片四周靖苇，晾干避光保存。
試劑
| 中文名 | 英文名 | 體積（ml) |
|---|---|---|
| 甲酰胺 | Formamide | 25 |
| 20*鹽-檸檬酸鈉緩沖液 | 20*SSC | 12.5 |
| 肝素 | Heparin (5 mg/ml) | 0.5 |
| 酵母tRNA*** | Yeast tRNA (50 mg/ml) | 0.5 |
| 檸檬酸(0.5 M pH=6.0) | Citric acid (0.5 M pH=6.0) | 0.92 |
| 焦碳酸二乙酯處理水 | DEPC*H2O | 10.33 |
| 20%吐溫20 | 20% Tween 20 | 0.25 |
***：臨用前加入
說明：
- 4% PFA是目前原位雜交組織化學技術(shù)中最常用的固定液班缰，它能較好地保持組織及細胞內(nèi)的RNA顾复，同時對形態(tài)保持也較好。通常組織塊固定4～12h鲁捏，載片固定時間在10～15min以內(nèi)，RNA含量較為恒定萧芙。過度延長固定時間會引起細胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)给梅，影響探針的穿透力，降低雜交效率双揪。
- 甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用动羽，以防過度消化（本操作無）。
參考資料：
[1]劉冀瓏. 果蠅組織熒光原位雜交[J]. Bio-101, 2019:1010301.
[2] Lecuyer E , Necakov A S , Caceres L , et al. High-resolution fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos and tissues.[J]. Csh Protoc, 2008, 2008(6):0-0.
[3] Nizami Z F , Liu J L , Gall J G . Fluorescent In Situ Hybridization of Nuclear Bodies in Drosophila melanogaster Ovaries[J]. Methods in Molecular Biology, 2015, 1328:137-149.
[4] Wilk R , Hu J , Krause H M . In Situ Hybridization: Fruit Fly Embryos and Tissues[J]. John Wiley & Sons, Inc. 2017.
