單分子實(shí)時(shí)定量測序技術(shù)（SMRT）
寫這篇筆記是因?yàn)榭赡芤院蟮墓ぷ髦袝?huì)用到這個(gè)技術(shù)逸邦，而我之前并不了解它。所以這篇文獻(xiàn)閱讀筆記就算是對SMRT先有個(gè)大體的認(rèn)識废离。這篇文章是2018年發(fā)表在Nucleic Acids Research雜志上的廊勃，題目是Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics滑进。我并不打算對這篇文獻(xiàn)的全文進(jìn)行翻譯钢颂，只挑其中的重點(diǎn)進(jìn)行記錄。如果有需要的同學(xué)可以自行下載這篇文章閱讀拜银。
摘要
短read的大量平行測序已經(jīng)是臨床診斷上的標(biāo)準(zhǔn)工具殊鞭。然而，短Read技術(shù)有其局限性尼桶，比如GC bias操灿， 比對到重復(fù)區(qū)域比較困難，對phasing等位基因也有一定的難度泵督。長read單分子測序可以解決這些難題趾盐。而且，它可以提供更高精確度小腊，并且檢測天然DNA的表觀修飾救鲤。第一個(gè)商業(yè)化的長read單分子測序平臺(tái)是RS系統(tǒng)，它基于PacBio的單分子實(shí)時(shí)定量測序技術(shù)秩冈，之后又有了RSII和Sequel系統(tǒng)本缠。這篇文獻(xiàn)主要講解SMRT測序是如何工作的，以及在生物各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用入问。
前言
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基因組研究和診斷都高度依賴DNA測序技術(shù)丹锹。測序技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，從產(chǎn)前診斷芬失，到新生兒篩查楣黍，再到診斷稀有疾病、腫瘤遺傳學(xué)形式棱烂、遺傳藥理學(xué)檢測和易患疾病的檢測租漂。
測序技術(shù)的歷史可以分為三個(gè)階段：一代、二代和三代垢啼。雖然早期的一代測序技術(shù)提供了開創(chuàng)的發(fā)現(xiàn)窜锯，但是測序技術(shù)最大的突破還是開始于“鏈終止”或者雙脫氧技術(shù)。也就是今天我們說的Sanger測序技術(shù)芭析∶化學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，以及從凝膠電泳到毛細(xì)管電泳的轉(zhuǎn)變馁启，使得目前的Sanger電泳儀能夠提供低通量驾孔，高達(dá)1 kb的高質(zhì)量讀取芍秆。Sanger測序仍作為孟德爾疾病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，和高通量測序結(jié)果的靶向驗(yàn)證翠勉。
21世紀(jì)的第一個(gè)十年妖啥，出現(xiàn)了多種DNA測序新方法。與第一代平臺(tái)相比对碌，這些新的第二代技術(shù)有更短的reads(最多幾百bp)荆虱，但有更高的通量(每次運(yùn)行高達(dá)數(shù)十億reads)。常見的基于熒光的短reads平臺(tái)包括Illumina橋式擴(kuò)增和測序的合成技術(shù)(如HiSeq和MiSeq)朽们，羅氏454焦測序儀怀读，利用寡核苷酸連接和檢測應(yīng)用生物系統(tǒng)的測序(SOLiD)平臺(tái)。還有的短reads平臺(tái)包括Ion Torrent測序儀骑脱，它通過聚合過程中釋放的氫離子導(dǎo)致的pH值差異來檢測核苷酸菜枷，而不是光信號。盡管這些短reads平臺(tái)已經(jīng)可以讓科學(xué)家在研究和臨床中快速尋找一組疾病基因叁丧、外顯子組啤誊，甚至整個(gè)人類基因組中的致病突變，但它們都有共同的缺陷和缺點(diǎn)拥娄。短read長度阻礙了對基因組復(fù)雜部分的reads分配蚊锹，變異體的相位，重復(fù)區(qū)域的測序条舔，并在從頭組裝中引入gaps和模糊區(qū)域枫耳。在擴(kuò)增步驟中，文庫制備和/或?qū)嶋H測序反應(yīng)中也會(huì)引入嵌合reads孟抗、重復(fù)大小的variation迁杨，以及GC富集區(qū)/缺乏區(qū)的代表性不足（underrepresentation）。綜上所述凄硼，這些缺點(diǎn)阻礙了診斷變異檢測的應(yīng)用铅协。
第三代測序一般以單分子測序?yàn)樘卣鳎c基于克隆的第二代測序方法有本質(zhì)區(qū)別摊沉。Helicos首次提供了基于熒光檢測和合成測序的單分子測序的商業(yè)應(yīng)用狐史。盡管缺乏擴(kuò)增偏差，比如GC-rich/poor區(qū)域的代表性不足说墨，這種早期的單分子測序仍然產(chǎn)生較短的reads長度(通常為35 bp)骏全。目前兩項(xiàng)較新的技術(shù)，PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測序和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔測序(nanopore)尼斧，提供了單分子測序的優(yōu)勢姜贡，包括超長的read長度(>20 kb)玲昧。這些平臺(tái)允許通過重復(fù)元素進(jìn)行測序/組裝令漂，直接的variant phasing身弊，甚至直接檢測表觀遺傳修飾雾狈。測序也只需幾個(gè)小時(shí)。雖然簡單和低成本的nanopore技術(shù)正在流行母怜，并可能代表未來的平臺(tái)余耽，SMRT測序目前更加成熟。
SMRT測序技術(shù)和原理
在SMRT測序之前苹熏，需要從雙鏈DNA材料制備文庫(圖1A)碟贾。這通常需要5微克或更多的DNA，這可能會(huì)限制一些情況下的應(yīng)用轨域。文庫的準(zhǔn)備工作包括：簡單地將Adapters連接到DNA分子上缕陕，從而將它們形成一個(gè)環(huán)狀，稱為SMRTbell的結(jié)構(gòu)(圖1B)疙挺。接下來，引物和聚合酶被退火結(jié)合到Adapter上怜浅，然后文庫被加載到一個(gè)SMRT Cell上铐然，這是一個(gè)包含150,000個(gè)納米級觀察小室(Zero Mode Waveguides，ZMWs)（RSII系統(tǒng)）恶座，在更新的Sequel平臺(tái)上可達(dá)100萬個(gè)小室搀暑。然后聚合酶結(jié)合的SMRTbells被加載到ZMWs中(圖1C)。理想情況下跨琳，一個(gè)ZMW應(yīng)該裝載一個(gè)SMRTbell自点。對于一個(gè)good run，大約三分之一到一半的ZMWs含有一個(gè)SMRT cell（另外1/3的ZMW里是空的脉让，還有1/3的ZMW里有一個(gè)以上的SMRTbell）桂敛。因此，對于RSII系統(tǒng)溅潜，SMRT cell通常產(chǎn)生約55000個(gè)reads术唬，對于Sequel系統(tǒng)產(chǎn)生約365000個(gè)reads(表1)。實(shí)際的測序反應(yīng)發(fā)生在每個(gè)ZMW內(nèi)滚澜，其小直徑僅允許最小的可用體積用于光檢測粗仓。每個(gè)ZMW中的聚合酶結(jié)合熒光標(biāo)記的核苷酸，發(fā)出熒光信號设捐，并被攝像機(jī)實(shí)時(shí)記錄下來(圖1C)借浊。這些信號被轉(zhuǎn)換成稱為連續(xù)的長序列，稱為continuous long reads (CLR)萝招、線性reads或聚合酶reads蚂斤。對于一個(gè)短的插入文庫，分子的圓形結(jié)構(gòu)導(dǎo)致插入序列被CLR覆蓋多次即寒。原始鏈的每過一遍橡淆，稱為subread召噩。此外，來自同一分子的所有subread可以組合成一個(gè)高度精確的一致序列逸爵，稱為環(huán)狀一致序列(CCS)或reads-of-insert(ROI)(圖1F-H具滴，左側(cè))。這兩個(gè)名詞通呈螅可以互換使用构韵，但根據(jù)定義，CCS需要兩個(gè)完整的序列趋艘，而ROI甚至可以從一個(gè)定義的部分開始疲恢。
由于對核苷酸加入的實(shí)時(shí)檢測，在測序過程中可以記錄聚合酶通過DNA鏈的速度瓷胧。兩個(gè)核苷酸加入之間的時(shí)間稱為脈沖間隔的持續(xù)時(shí)間(IPD)显拳，它受DNA表觀遺傳變化的影響(圖1 D和E)。在測序過程中由于聚合酶不是只hold一個(gè)核苷酸搓萧，而是hold大約十二個(gè)核苷酸杂数，所以一個(gè)核苷酸表觀遺傳變化可以影響周圍的核苷酸的結(jié)合率。這就產(chǎn)生了一個(gè)“fingerprint”瘸洛，其中一些已經(jīng)被鑒定出來了揍移，比如6-mA，4-mC和(tet轉(zhuǎn)換)5-mC反肋。
除了更少但更長的read之外那伐，PacBio數(shù)據(jù)與短read測序技術(shù)在幾個(gè)方面存在差異。首先石蔗，reads不是一個(gè)固定的長度罕邀，而是一個(gè)reads長度的分布，它取決于每個(gè)聚合酶的活性养距。由于在文庫準(zhǔn)備和測序過程中都不需要擴(kuò)增燃少，因此幾乎不存在GC偏倚。在與第二代平臺(tái)相反铃在，原始的PacBio的reads在錯(cuò)誤類型上也不同(indels多于mismatches)阵具，而且數(shù)量更高(～13-15%，表1)定铜，不過它們是隨機(jī)分布在reads之間的阳液。這種隨機(jī)性使高度準(zhǔn)確的(> 99%)來建立對同一分子進(jìn)行快速多次測序(CCS reads)，或通過結(jié)合來自相同的軌跡的不同的CLR(圖1 G和H)揣炕。同時(shí)帘皿，擴(kuò)散上樣（diffusion loading）創(chuàng)建一個(gè)偏好于對短分子測序的run。這種loading偏差可以通過以下方法得到緩解：使用磁珠上樣畸陡，使<1 kb的分子不能與ZMWs底部結(jié)合鹰溜；選擇size以去除短分子虽填；以及/或在上樣過程中加入聚乙二醇以增強(qiáng)大分子DNA分子的包裝。在不久的將來曹动，通過施加電場迫使帶電分子進(jìn)入ZMW斋日，可以實(shí)現(xiàn)長度獨(dú)立的上樣。
為了解決這些本質(zhì)上不同的reads墓陈，生物信息分析需要采用現(xiàn)有的工具并開發(fā)新的方法恶守，例如比對和組裝。許多PacBio特定工具和pipelines(包括多路分解贡必，創(chuàng)建CCS reads兔港，長擴(kuò)增子分析，重頭組裝和表觀遺傳分析)中可用PacBio SMRT分析套件(開源的仔拟，www.pacb.com/support/softwaredownloads/)衫樊，通過命令行或其SMRT Portal和SMRT鏈接圖形用戶界面進(jìn)行分析。
SMRT在腫瘤研究中的應(yīng)用
在癌癥患者的治療過程中利花，監(jiān)測可能導(dǎo)致惡性細(xì)胞增殖優(yōu)勢的低頻率突變是至關(guān)重要的橡伞。慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種血液癌癥，它是由9號染色體和22號染色體之間的易位引起的晋被，導(dǎo)致BCR-ABL1融合蛋白的產(chǎn)生。CML患者通常使用酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)抑制BCR-ABL1刚盈，但該治療可誘導(dǎo)點(diǎn)突變羡洛，導(dǎo)致耐藥。因此藕漱，篩選TKI治療效果不好的CML患者的BCR-ABL1基因欲侮，并研究其突變情況是很重要的。在Cavelier等人的研究中肋联，從BCR-ABL1的cDNA構(gòu)建了一個(gè)約1.5 kb的擴(kuò)增子威蕉。SMRT測序可以檢測到1%水平的TKI耐藥突變，與Sanger測序15-20%的檢測閾值相比橄仍，顯著降低（換句話說就是靈敏度提高了很多）韧涨。此外，有可能對共存突變進(jìn)行相位分析侮繁，從而提供有關(guān)BCR-ABL1耐藥突變克隆分布的新信息虑粥，并識別許多不同的剪接亞型。除了BCR-ABL1之外宪哩，還有其他一些適合SMRT測序的臨床靶標(biāo)基因(表2)娩贷。在一項(xiàng)腫瘤抑制基因TP53的loss-offunction突變研究中，SMRT測序顯示锁孟，在急性髓細(xì)胞白血病(AML)和myelodysplatic綜合征(MDS)患者中彬祖，擁有多個(gè)TP53突變茁瘦，分布在不同的等位基因。未來储笑，關(guān)于TP53亞克隆異質(zhì)性的詳細(xì)信息可以用來指導(dǎo)這些患者的治療甜熔。在與癌癥無關(guān)的其他類型的體細(xì)胞變異中也可以檢測到微小的變異。Gudmunsson等人利用SMRT測序獲得了導(dǎo)致角膜炎-魚鱗病-耳聾綜合征患者皮膚損傷修復(fù)的GJB2的體細(xì)胞嵌合突變的相位信息南蓬。
全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序(后面將介紹)目前還只能用于研究纺非，但在不久的將來將成為診斷的選擇。已經(jīng)進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組SMRT測序已被應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞模型赘方，以識別已知癌基因Her2的新基因融合事件(案例研究:www.pacb.com/wp-content/uploads/Case-Study-Scientists-deconstruct-cancer-complexitythrough-genome-and-transcriptome-analysis.pdf)烧颖。前列腺細(xì)胞模型的全轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)了前列腺癌中新的RLN1和RLN2基因融合。重要的是窄陡，SMRT測序可以提供更精確的癌癥基因結(jié)構(gòu)炕淮，Kohli等人的一項(xiàng)研究證實(shí)了這一點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中跳夭，在AR-V9中檢測到一種以前認(rèn)為只存在于AR-V7中的隱性外顯子涂圆。AR-V7已被作為前列腺癌耐藥的潛在生物標(biāo)志物，其基礎(chǔ)是實(shí)際上針對這兩種亞型的敲除實(shí)驗(yàn)币叹。因此润歉，AR-V9實(shí)際上可能是耐藥性的預(yù)測性生物標(biāo)志物。
表觀遺傳學(xué)的全面變化也是癌癥的一個(gè)標(biāo)志颈抚。單分子實(shí)時(shí)亞硫酸氫鹽測序(SMRTBS)能夠定量并高度多路檢測1.5 - 2kb擴(kuò)增子的甲基化踩衩。這是對以前技術(shù)的改進(jìn)，以前的技術(shù)只能針對典型的亞硫酸氫鹽PCR大小(約為300-500 bp)贩汉，并且有可能評估人類基因組中約91%的CpG島驱富。到目前為止，該方法已應(yīng)用于多種腫瘤細(xì)胞系匹舞，包括急性髓系白血病褐鸥、慢性髓系白血病、間變性大細(xì)胞淋巴瘤赐稽、漿細(xì)胞白血病叫榕、Burkitt淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤姊舵。擴(kuò)展到全基因組診斷翠霍，當(dāng)對非擴(kuò)增的材料進(jìn)行全基因組SMRT測序時(shí)，理論上可以根據(jù)IPD比值確定所有核苷酸的表觀遺傳狀態(tài)蠢莺。
Future:全轉(zhuǎn)錄本和全基因組測序
傳統(tǒng)上寒匙，RNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，然后片段化進(jìn)行短reads測序(RNA-seq)。將RNA-seq檢測到的外顯子組裝成單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄本非常困難锄弱，并容易出錯(cuò)考蕾。SMRT測序不需要片段化，稱為Iso-Seq会宪。這是一種理想的完整cDNA測序方法肖卧。Iso-Seq已經(jīng)被用于全轉(zhuǎn)錄組測序，樣品來自一個(gè)正常的中國成年男性的血液掸鹅，20個(gè)不同正常的人體組織和器官的RNA庫塞帐，三個(gè)lymphoblastoid轉(zhuǎn)錄組，以及前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞模型(案例研究: www.pacb.com/wpcontent/uploads/Case-Study-Scientists-deconstruct-cancer-complexity-throughgenome-and-transcriptome-analysis.pdf)巍沙。與復(fù)雜的短reads比對和重組不同葵姥，這些論文證明長reads可以很容易地檢測到人類基因中的剪接異構(gòu)體（splicing
isoforms）。除了檢測大量已知的亞型外句携，該方法還識別了以前短reads測序未檢測到的新剪接形式和基因(93)榔幸。與基因組variant相位類似，對于轉(zhuǎn)錄的單核苷酸變異的基因位點(diǎn)矮嫉，這些可以用來精確地確定哪個(gè)等位基因異構(gòu)體被表達(dá)削咆。雖然Iso-Seq在轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)確定方面很特殊，但與第二代平臺(tái)相比蠢笋，其低通量目前限制了其用于表達(dá)分析拨齐。然而，隨著成本的降低和通量的增加昨寞，無bias的PacBio表達(dá)和isoform檢測將在不久的將來成為常規(guī)方法瞻惋。
全基因組測序(WGS)已成為研究人類基因組變異的一種廣泛使用的方法。然而编矾，這些短reads的性質(zhì)只提供SNP和小插入/刪除以外有限的variation信息。SMRT測序極大地?cái)U(kuò)展了WGS的用途馁害，允許更大的組裝完整性(BioRxiv:https://doi.org/10.1101/067447)窄俏，甚至接近參考基因組的contig大小。這些PacBio的WGS也顯示出大量的變異被短reads的WGSs所遺漏碘菜。從人類個(gè)體的從頭組裝中還發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)值得注意的發(fā)現(xiàn)凹蜈，即似乎存在若干個(gè)megabases的新序列，即目前人類參考基因組(GRCh38)中所沒有的序列忍啸。例如仰坦，Shi等人在他們重新組裝的個(gè)體基因組中發(fā)現(xiàn)了12.8 Mb的新序列，這相當(dāng)于整個(gè)人類基因組(約為3 Gb)的0.4%以上计雌。此時(shí)悄晃，我們還不知道這個(gè)新序列是否在所有人類個(gè)體中都存在(因此在GRCh38中缺失)，或者它是否主要代表了僅在某些特定個(gè)體或群體中發(fā)現(xiàn)的序列變異÷栝希總的來說庶近，這些WGS研究表明，長read測序可以識別大量短read平臺(tái)遺漏的變異眷蚓，包括那些與臨床診斷相關(guān)的變異鼻种。
下面還有一些參考的文章和視頻，講的都挺好的沙热，我就列了出來叉钥，供參考：
1.從零開始完整學(xué)習(xí)全基因組測序（WGS）數(shù)據(jù)分析：第1節(jié) DNA測序技術(shù)
2.【三代】淺談三代測序平臺(tái)
3.https://youtu.be/_lD8JyAbwEo
4.陳巍學(xué)基因視頻3：Pacific Biosciences Sequencing
