近期的一系列際遇都再次論證了我真的是一個靠運氣闖蕩江湖的人，鬼使神差的混入了一個超棒的實驗室搭综，并且受到了同伴和室友在工作和生活上的無私的照顧战得。日子像夢一樣美好控嗜，我只想時間走的再慢一點唁毒，讓我能把這里的四季再多看一眼蒜茴，再看清楚一些。
記得之前果子老師說過浆西，靠輸出倒逼輸入粉私，我想嘗試著把我的學習過程記錄下來，理清思路近零，同時也許還能認識更多的再學習路上的小伙伴诺核。（我真的考大學都沒有這么努力過，倒著時差學習久信，哈哈）
就從這篇最經典的Drop-seq文章開始吧窖杀。
Russell 告訴我，這篇文章只需要看懂前兩個圖裙士，我們來看看它們講了什么入客。
圖一（本文的圖一，文章中的圖二）
我來嘗試以我的思路講清楚它腿椎。
無論出于什么原因桌硫，你希望能夠測到一個cell里面的轉錄組（transcriptome），根據(jù)illumina的測序儀啃炸，你是不可能在最后一步一個細胞一個細胞單獨測的（我了解的不多铆隘，不知道這句話是否正確），所以一個正常的思路是肮帐，給每一個細胞一個單獨的標記咖驮，并且，希望在標記的過程中每一個細胞都是分開的训枢，并且不會互相接觸到托修，這行在標記的過程中，才不會混恒界。
那么睦刃，我們如何實現(xiàn)這個過程呢？
首先十酣，為了保證你的細胞在標記的過程中是分開的涩拙，這波人發(fā)明了一個叫做微流體設備的東西（microfuidic device）
里面有三個上樣孔，在其中你可以分別加入1耸采、你的樣本細胞懸液兴泥，2、Gel Beads 3虾宇、partitioning oil搓彻。像下圖中一樣。
然后它就可以啟動圖一A中的流程，當細胞流過時旭贬，會被與beads結合然后被油滴包裹怔接，形成一個油包水的密閉小液滴（droplet）。細胞和microparticle（beads）相遇會裂解稀轨，釋放出里面的各種物質扼脐，RNA（mRNA，tRNA奋刽，rRNA）瓦侮，蛋白質，脂質佣谐，DNA等等各種物質脏榆。因為beads上聯(lián)接了接頭，其中有一段是ploy （dT）序列（30）個台谍，在細胞裂解釋放的核酸中，只有mRNA帶有polyA的尾巴吁断，于是這段beads上面ploy （dT）就可以從眾多的裂解產物里捕獲到mRNA趁蕊。這也就是Russell問我為什么Drop-seq要用3'端測序的原因了。
Maxter Mix中帶有反轉錄試劑仔役，當mRNA被捕獲后掷伙，就可以從它的3‘端開始作為模板，進行反轉錄出cDNA的第一條鏈又兵，這第一條鏈就沿著poly（dT）序列延申任柜，長在了beads上，形成了圖一7中的STAMPs沛厨，接著我們把序列洗脫宙地，以cDNA的第一條鏈為模板，進行PCR逆皮，合成cDNA的第二條鏈宅粥，然后就是我們熟悉的（我其實不熟悉，哈哈）cDNA擴增电谣，illumina測序啦秽梅。
我們如何知道那些序列是來自那個細胞的？或者說剿牺，single cell的RNA-seq和bulk的RNA-seq的最大區(qū)別在哪里呢企垦？是Barcode，或者說是Cell barcode晒来。每一個beads上都有著相同的Cell barcode钞诡，而beads與beads間的Cell barcode是不同的，假設每個beads只捕獲一個cell，那么則每個cell都被cell barcode 單獨標記了臭增。
如何保證每一beads只捕獲一個cell呢懂酱？第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的數(shù)目遠遠超過cell的數(shù)目誊抛，即絕大多數(shù)的beads都是空的列牺，只有少數(shù)的才捕獲到了cell。但是還是有個別的droplet里面會兩個或者更多的細胞拗窃，這就需要我們去QC啦瞎领。
single cell RNA-seq的barcode這么神奇，我們結合10x Genomics的說明書一起來分步驟詳解一下随夸。
先來看看這些區(qū)段都是用來做什么的九默。
由內向外：
Poly（dT）：用來和polyA結合，捕獲mRNA
UMI：用來標記不同的PCR產物（數(shù)count）
10xBarcode：用來標記不同的細胞
Sample Index：用來標記不同的樣本
Truseq Read 1宾毒、2 ：用來進行連接beads驼修，cDNA的PCR擴增和加P7接頭
P5和P7：用來進行illumina的橋式PCR測序。
在這些序列中诈铛，P5乙各、P7、Read 1幢竹、2 的序列是已知的
和beads上連接的序列最開始只有Read1 耳峦，10x Barcode，和poly（dT）焕毫，其他的這些接頭是怎樣一步步加上蹲坷，并且發(fā)揮作用的？10xGenomics的說明書上給了具體步驟邑飒。我看下來循签，覺得最主要的思想，就是用已知的序列設計引物疙咸，PCR出未知的序列懦底。
利用Poly（dT）來捕獲mRNA，反轉錄出cDNA的第一條鏈罕扎，并且在cDNA的末端加上CCC序列聚唐，和TSO序列的GGG序列互補，并以TSO序列為模板腔召，繼續(xù)延申杆查。這其實很重要，因為中間cDNA的序列我們是不知道的臀蛛，如果不加上這個接頭亲桦，就沒有辦法設計引物崖蜜，合成cDNA的第二條鏈。
對TSO序列和Read1 設計引物客峭，合成cDNA的第二條鏈豫领，并完成cDNA的擴增。
因為II代測序illumina測序不能測很長舔琅，約為200-700bp等恐，所以不能測得mRNA全長，所以會把合成的cDNA利用酶打斷到illumina能測的長度备蚓，然后再兩邊加上接頭课蔬，Read2。 設計部分與Read1和Read2重疊的引物郊尝，加上P5二跋，P7和sample index，就可以去進行illumina測序了流昏。
我畫了一張圖（homework扎即，哈哈），加上了序列况凉，用來弄清楚這個過程铺遂。
下一步是再看一遍說明書，對著這個過程茎刚，弄懂每個操作是在干什么。
小刀老師說：好好學習撤逢，天天向上疤哦А！
