Author：ligc

Date：19/5/12

1. 一代測(cè)序(Sanger sequencing)

雙脫氧鏈終止法采用DNA復(fù)制原理。 Sanger測(cè)序反應(yīng)體系中包括目標(biāo)DNA片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）携狭、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測(cè)序引物及DNA聚合酶等。 測(cè)序反應(yīng)的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基團(tuán)抖坪，不具有與另一個(gè)dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力壹蔓，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸匠襟。此外家夺，這些ddNTP上連接有放射性同位素或熒光標(biāo)記基團(tuán)脱柱，因此可以被自動(dòng)化的儀器或凝膠成像系統(tǒng)所檢測(cè)到。

設(shè)置四個(gè)反應(yīng)體系1-4拉馋，分別加入引物褐捻、DNA聚合酶、四種dNTP椅邓、一定比例的ddNTP（帶有放射性標(biāo)記）例如1中是ddATP，它就負(fù)責(zé)測(cè)定T堿基的位置昧狮；依次2是ddCTP景馁，3是ddTTP， 4是ddGTP逗鸣。假如擴(kuò)增過程中ddATP遇到了T位點(diǎn)合住，就結(jié)合并終止（因?yàn)閐dNTP的2‘和3'都沒有羥基）,一段時(shí)間內(nèi)大量的ddNTP會(huì)結(jié)合完所有測(cè)序位點(diǎn)。

最后利用凝膠電泳和放射自顯影只能看到帶有熒光標(biāo)記的ddNTP撒璧，他們的排列順序先利用電泳條帶前后關(guān)系確定下透葛，再用A-T, T-A, C-G, G-C關(guān)系反轉(zhuǎn)一下，就能知道我們的測(cè)序序列卿樱。

sanger

一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)就是測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp僚害，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，二三代所不能及）繁调，但它的通量低萨蚕，成本高。目前一代測(cè)序在驗(yàn)證序列（就是平時(shí)送公司測(cè)序返回來自己blast的那些）以及驗(yàn)證基因組組裝完整性方面都是金標(biāo)準(zhǔn)蹄胰。

2. 二代測(cè)序(sequencing by synthesis,SBS）

Roche公司的454技術(shù)岳遥、illumina公司的Solexa/Hiseq技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)標(biāo)志第二代測(cè)序技術(shù)誕生。其中Roche公司的454測(cè)序系統(tǒng)是第二代測(cè)序技術(shù)中第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)的測(cè)序平臺(tái)裕寨。
其中Illumina市場(chǎng)規(guī)模占到75%以上浩蓉，主要包括Miseq，Hiseq宾袜。下面??就主要介紹它的PE（Pair End雙端）測(cè)序原理：

2.1文庫(kù)構(gòu)建

名詞：
flowcell： 測(cè)序反應(yīng)的載體/容器捻艳，1個(gè)flowcell有8個(gè)lane
lane： 測(cè)序反應(yīng)的平行泳道，試劑添加试和、洗脫等過程的發(fā)生位置
tile： 每次熒光掃描的位置讯泣，肉眼是看不到的
雙端測(cè)序： 可能序列比較長(zhǎng)有四五百bp，兩邊各測(cè)120-150bp
junction： 雙端測(cè)序中間一些沒有測(cè)到的區(qū)域
index(barcode)：一個(gè)lane通常要測(cè)多個(gè)樣品阅悍，每個(gè)樣品都加上特定的序列標(biāo)簽好渠，用于區(qū)分不同樣品昨稼。
flowcell構(gòu)造：一個(gè)lane包含兩列（swath），每一列有60個(gè)tile拳锚，每個(gè)tile會(huì)種下不同的cluster假栓，每個(gè)tile在一次循環(huán)中會(huì)拍照4次（每個(gè)堿基一次）

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打斷以后會(huì)出現(xiàn)末端不平整的情況，用酶補(bǔ)平霍掺，所以現(xiàn)在的序列是平末端匾荆。
完成補(bǔ)平以后，在3'端使用酶加上一個(gè)特異的堿基A杆烁，加上A之后就可以利用互補(bǔ)配對(duì)的原則牙丽，加上adapter，這個(gè)adpater可以分成兩個(gè)部分兔魂，一個(gè)部分是測(cè)序的時(shí)候需要用的引物序列烤芦，另一部分是建庫(kù)擴(kuò)增時(shí)候需要用的引物序列。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增析校，使得我們的DNA樣品濃度足夠上機(jī)要求构罗。

library construction

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什么是插入片段？

reads1 與 reads2 不發(fā)生重疊

• 圖中是Pair-End(PE)測(cè)序智玻，測(cè)的是兩個(gè)末端遂唧，得到的序列是Read1和Read2，很多時(shí)候Read1+Read2的長(zhǎng)度都是小于這個(gè)插入片段的長(zhǎng)度的吊奢。在不測(cè)通的情況下盖彭，它中間一定有一段不明長(zhǎng)度的序列我們無法測(cè)到，這段不被測(cè)到的序列有時(shí)被稱為Inner序列事甜，它的長(zhǎng)度是Read1和Read2相距的距離谬泌。
  
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  reads1 與 reads2 發(fā)生重疊
• 測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，比如MiSeq的測(cè)序讀長(zhǎng)可以到達(dá)250bp逻谦，PE測(cè)的話掌实，Read1+Read2就達(dá)到500bp，如果我們的建庫(kù)序列長(zhǎng)度是400bp邦马，那么就會(huì)被測(cè)通贱鼻，而且中間有約100bp是Read1和Read2重疊測(cè)到的區(qū)域。
  
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  測(cè)通
  它是Read重疊的進(jìn)一步延伸滋将，原因是相同的邻悬，就是有些插入片段長(zhǎng)度太短了，導(dǎo)致Read能夠完全跨越整個(gè)插入片段随闽，比如圖里父丰，所有長(zhǎng)度小于100bp的插入片段，它們都會(huì)被測(cè)通，而且還會(huì)直接測(cè)到片段兩端的接頭序列蛾扇，這時(shí)就需要對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行cut adapter攘烛。
  
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2.2 上樣

flowcell是用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道，測(cè)序就在此進(jìn)行镀首。上面構(gòu)建好的文庫(kù)中的待測(cè)序列事先配置好一定的濃度坟漱，經(jīng)過這里的時(shí)候，會(huì)在特異的化學(xué)試劑作用下更哄，強(qiáng)力隨機(jī)地附著在lane上芋齿，與上面的短序列配對(duì)。上樣的結(jié)果就是lane吸附住了沖過來的DNA成翩，并且可以在表面進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增觅捆。

2.3 橋式PCR

• 第一輪擴(kuò)增模版：flowcell表面固定的序列 --> 模版鏈
• 去雜：加入NaOH強(qiáng)堿性溶液使雙鏈DNA變性，互補(bǔ)鏈由于和lane上短序列強(qiáng)力連接固定住了麻敌；模板鏈?zhǔn)チ穗p鏈氫鍵連接惠拭，好似懸空，它會(huì)被洗脫庸论。
• 橋式形成： 加入緩沖溶液，互補(bǔ)鏈的p7‘和lane上的p7互補(bǔ)（但還是一個(gè)lane中的）就像下圖這樣（摘自illumina官網(wǎng)）目的是快速擴(kuò)增lane p7接頭連接的鏈棒呛，也就是下圖中的Forward Strand聂示，它和我們的模版鏈?zhǔn)且恢碌摹Ｎ覀兒髞頊y(cè)序只用這一半簇秒。
• 橋式PCR： PCR彎成橋狀鱼喉，一輪橋式擴(kuò)增一倍。
• 循環(huán)： 大約35個(gè)循環(huán)后趋观，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束扛禽，稱為cluster，這是一群完全相同的序列皱坛。目的在于實(shí)現(xiàn)放大單一堿基的信號(hào)強(qiáng)度编曼，滿足后期測(cè)序需求。

• 解鏈： 橋式PCR完成后剩辟，形成了很多的橋形的互補(bǔ)雙鏈掐场，再次強(qiáng)堿解鏈。這一次不再進(jìn)行復(fù)制贩猎，而是利用一種酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane 上p5‘ 連接的鏈熊户，只留下了與lane p7連接的鏈即Forward Strand。

  
  
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2.4 測(cè)序

雙端測(cè)序之Forward Strand：

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• 先是primer結(jié)合到靠近p5的sequencing primer binding site1上吭服，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羥基被疊氮基團(tuán)替代嚷堡，因此每次只能添加一個(gè)dNTP；還含有熒光基團(tuán)艇棕，能激發(fā)不同顏色】蝌戒；
• 在dNTP被添加到合成鏈上后串塑，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉；再加入激發(fā)熒光緩沖液瓶颠，用激光激發(fā)熒光信號(hào)拟赊，光學(xué)設(shè)備記錄熒光信號(hào)的記錄，計(jì)算機(jī)將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基粹淋，這一個(gè)循環(huán)就能測(cè)定flowcell上成千上萬的cluster吸祟，這就實(shí)現(xiàn)了高通量。
• 再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并使dNTP 3’ 疊氮基團(tuán)變成羥基桃移，這樣能繼續(xù)向下進(jìn)行再加一個(gè)屋匕，并且保證這個(gè)不再發(fā)出熒光。如此重復(fù)直至所有鏈的堿基序列被檢測(cè)出借杰。得到了Forward Strand序列过吻。
• 因?yàn)橐粋€(gè)cluster的序列是一樣的，所以理論上cluster的熒光顏色應(yīng)該一致蔗衡。
  
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  Index測(cè)序： 上面的循環(huán)結(jié)束后纤虽，read product被沖掉，index1 primer和鏈上的index1 互補(bǔ)配對(duì)绞惦，進(jìn)行index1的檢測(cè)逼纸。測(cè)完后，洗脫產(chǎn)物济蝉，得到index1 的序列杰刽。接下來p5與lane上的p5‘配對(duì)，測(cè)得了index2王滤，并洗脫贺嫂。
  
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  雙端測(cè)序之Reverse Strand：
  洗脫掉index2 產(chǎn)物后，還是一個(gè)橋式擴(kuò)增雁乡，得到雙鏈第喳，再變性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去測(cè)完的Forward strand踱稍。然后和測(cè)Forward一樣墩弯，也是先連接primer，只是連接的位點(diǎn)是Primer Binding Site2寞射，測(cè)完后得到reverse strand序列渔工。

single-end只將index，Primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端桥温，另一端直接連上P5/P7引矩，將片段固定在Flowcell上橋式PCR生成DNA簇，然后單端測(cè)序讀取序列

為什么Illumina測(cè)序會(huì)有長(zhǎng)度限制呢？

1. 測(cè)序時(shí)旺韭，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的PCR氛谜，會(huì)有不同步的情況。通俗一點(diǎn)講区端，比如一開始1個(gè)cluster中是100個(gè)完全一樣的DNA鏈值漫，但是經(jīng)過1輪增加堿基，其中99個(gè)都加入了1個(gè)堿基织盼，顯示了紅色杨何，另外1個(gè)沒有加入堿基，不顯示顏色沥邻。這時(shí)候整體為紅色危虱，我們可以順利得到結(jié)果。隨后唐全，在第2輪再加入堿基進(jìn)行合成的時(shí)候埃跷，就變成了，之前沒有加入的加入了1個(gè)堿基顯示紅色邮利，剩下的99個(gè)顯示綠色弥雹，這個(gè)時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)雜信號(hào)。當(dāng)測(cè)序長(zhǎng)度不斷延長(zhǎng)延届，這個(gè)雜信號(hào)會(huì)越來越多缅糟，最后很有可能出現(xiàn)，50個(gè)紅祷愉，50個(gè)綠色，這時(shí)候我們判斷不出來到底是什么堿基被合成赦颇。
   2.測(cè)序過程中二鳄，使用的堿基是特殊處理的，有一個(gè)非常大的熒光基團(tuán)修飾媒怯。在使用DNA ploymerase的時(shí)候订讼，酶的狀態(tài)也會(huì)受到底物的影響，越來越差扇苞。

2.5 數(shù)據(jù)產(chǎn)生：

Hiseq2000測(cè)序儀
測(cè)序儀搭配了兩個(gè)flowcell欺殿，簡(jiǎn)稱雙流動(dòng)槽。比較經(jīng)典的Hiseq2500一次能產(chǎn)出700-800Gb數(shù)據(jù)（此處Gb為測(cè)序堿基數(shù)鳖敷，不同于字節(jié)數(shù)的Gb）
數(shù)據(jù)量=單端reads長(zhǎng)度 * 單端reads個(gè)數(shù) * 2（PE)
測(cè)序深度=數(shù)據(jù)量大小 / 參考基因組大小

第三代測(cè)序技術(shù)

這是一個(gè)新的里程碑脖苏。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為標(biāo)志，被稱之為第三代測(cè)序技術(shù)定踱。與前兩代相比棍潘，最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，超長(zhǎng)讀長(zhǎng)亦歉，平均達(dá)到10Kb-15Kb恤浪，是二代測(cè)序技術(shù)的100倍以上，值得注意的是在測(cè)序過程中這些序列的讀長(zhǎng)也不再是相等的肴楷。

PacBio SMRT

• PacBio SMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想水由，并以SMRT芯片為測(cè)序載體（如同flowcell）∪瑁基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合砂客，用4色熒光標(biāo)記A,C,G,T這4種堿基（即是dNTP）。在堿基的配對(duì)階段濒募，不同的堿基加入鞭盟，會(huì)發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型瑰剃。

  
  
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這個(gè)DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一齿诉，讀長(zhǎng)主要跟酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響晌姚。PacBio SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是在于如何將反應(yīng)信號(hào)與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來粤剧。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。這些小孔的直徑是有嚴(yán)格要求的挥唠，如果直徑大于微波波長(zhǎng)抵恋，能量就會(huì)在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板從而泄露出來（光波的衍射效應(yīng)），從而與周圍小孔相互干擾（光波的干涉）宝磨。如果孔徑能夠小于波長(zhǎng)弧关，那么能量就不會(huì)輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)唤锉，從而可起到保護(hù)的作用世囊。同理，在一個(gè)反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實(shí)時(shí)反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔,窿祥，即 ZMW(零模波導(dǎo)孔)株憾，外徑100多納米，比檢測(cè)激光波長(zhǎng)小(數(shù)百納米)晒衩，激光從底部打上去后不會(huì)穿透小孔進(jìn)入上方的溶液區(qū)嗤瞎，能量會(huì)被限制在一個(gè)小范圍(體積20X 10-21 L)里，正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分听系，使得信號(hào)僅僅只是來自于這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域贝奇，孔外過多的游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實(shí)現(xiàn)將背景噪音降到最低的目的靠胜。

• PacBio SMRT技術(shù)除了能夠檢測(cè)普通的堿基之外弃秆，還可以通過檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間届惋，來檢測(cè)堿基的表觀修飾情況，如甲基化菠赚。因?yàn)榧僭O(shè)某個(gè)堿基存在表觀修飾脑豹，則通過聚合酶時(shí)的速度會(huì)減慢，那么相鄰兩峰之間的距離會(huì)增大衡查，我們可以通過這個(gè)時(shí)間上的差異來檢測(cè)表觀甲基化修飾等信息瘩欺。
• SMRT技術(shù)的測(cè)序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP拌牲。但這么快的測(cè)序速度也帶來了一些明顯的缺點(diǎn)——測(cè)序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通簿愣觥），可以達(dá)到10%-15%塌忽，而且以缺失序列和錯(cuò)位居多拍埠，但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在一定的堿基偏向（PCR biasing）土居，因此可以通過多次測(cè)序來進(jìn)行有效糾錯(cuò)枣购。

Oxford Nanopore

• 這個(gè)技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于他們所設(shè)計(jì)的一種特殊納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合分子接頭擦耀。當(dāng)DNA分子通過納米孔時(shí)棉圈，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的）眷蜓，最后高靈敏度的電子設(shè)備檢測(cè)到這些變化從而鑒定所通過的堿基分瘾。

  
  
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• 納米孔測(cè)序以及其他第三代測(cè)序技術(shù)，有可能會(huì)徹底地解決目前第二代測(cè)序平臺(tái)的諸多不足吁系。另外德召，MinION的主要特點(diǎn)是：讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，而且比PacBio的都長(zhǎng)得多汽纤，基本都是在幾十kb上百kb以上上岗，最新的數(shù)據(jù)顯示可以達(dá)到900 kb！錯(cuò)誤率是5%-15%冒版，也是隨機(jī)錯(cuò)誤，MinION最大的特點(diǎn)除了極小的體積之外逞姿，就是數(shù)據(jù)將是可實(shí)時(shí)讀取/的辞嗡，并且起始DNA在測(cè)序過程中不被破壞！這種納米孔單分子測(cè)序儀還有另一大特點(diǎn)滞造，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶续室，而不必像二代測(cè)序方法那樣需要事先對(duì)基因組進(jìn)行bisulfite（酸性亞硫酸鹽）處理。這對(duì)于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助谒养。

參考文章：

1.http://www.reibang.com/p/101c14c3a1d2
2.https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684
3.https://mp.weixin.qq.com/s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg
4.https://mp.weixin.qq.com/s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A