慢病毒包裝
- 簡單和復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒都含有兩份線性针饥、不分節(jié)段的、長7-12 kb的單鏈RNA袁梗，編碼gag, pol和env基因鲁猩。
- Gag編碼一種多聚蛋白，翻譯自一條無拼接的mRNA岖沛，mRNA然后被病毒蛋白酶（PR）切割成MA暑始、CA和NC蛋白。
- Pol表達(dá)的是Gag-Pol多聚蛋白婴削，編碼RT廊镜、PR和IN三種酶。這三種蛋白附著在病毒粒子的基因組上唉俗。RT蛋白擁有如下三種活性：（a） RNA依賴的DNA聚合酶活性嗤朴，負(fù)責(zé)將兩條RNA轉(zhuǎn)錄成一個(gè)cDNA；（b） 核糖核酸酶H活性虫溜；（c） DNA依賴的DNA聚合酶活性雹姊。PR用于切割Gag和Gag-Pol多聚蛋白，導(dǎo)致病毒粒子的成熟和產(chǎn)生具感染能力的病毒粒子衡楞。IN負(fù)責(zé)將病毒的cDNA整合至宿主細(xì)胞基因組中容为。一旦整合完畢，病毒基因組便與宿主細(xì)胞染色體相連寺酪，稱為前病毒
- Env基因也編碼一種多聚蛋白前體坎背，前體被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶切割成表面包膜糖蛋白（SU）gp120和跨膜（TM）糖蛋白gp41。其中寄雀，gp120與細(xì)胞表面受體和輔助受體相互作用得滤，gp41在病毒膜上與gp120形成gp120／gp41復(fù)合體，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)催化膜融合盒犹。
- 復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組區(qū)別于簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的地方主要在于前者存在一套附屬基因懂更，其產(chǎn)物涉及到轉(zhuǎn)錄調(diào)控眨业、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、基因表達(dá)與裝配沮协。其中包括Rev和Tat蛋白以及Vpu龄捡、Vif、Vpr和Nef這些附屬蛋白慷暂。Rev是一種RNA結(jié)合蛋白聘殖，保證晚期基因的表達(dá)。它還對(duì)未拼接的和單股拼接的mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)來講非常重要行瑞，它編碼從核到細(xì)胞質(zhì)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白奸腺。Tat是一種RNA結(jié)合蛋白，起到增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用血久。Nef蛋白抑制T細(xì)胞激活突照。Vpu能增強(qiáng)病毒進(jìn)入過程中從細(xì)胞表面到細(xì)胞質(zhì)中的釋放。Vif蛋白是慢病毒復(fù)制所必須的氧吐，因?yàn)樗芟抡{(diào)宿主的抗病毒反應(yīng)
- 慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒HIV讹蘑，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族。野生型慢病毒的5'LTR可以驅(qū)動(dòng)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄筑舅，3'LTR能夠終止上游轉(zhuǎn)錄衔肢。但LTR可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞原癌基因鄰近處，使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞豁翎。因此角骤，在慢病毒載體中需要?jiǎng)h除5'LTR的部分序列，提高慢病毒載體的安全性心剥。此外邦尊，通過刪除與病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因形成復(fù)制缺陷型的慢病毒顆粒，限制其在靶細(xì)胞中的大量復(fù)制优烧，提高生物安全性蝉揍。
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在程序上，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)重要區(qū)別在于：對(duì)慢病毒載體莱褒，通常包裝击困、包膜和轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系，而對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體广凸，只有轉(zhuǎn)運(yùn)載體才轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系內(nèi)阅茶，而細(xì)胞系早已穩(wěn)定表達(dá)另外兩種載體.
- 選擇轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒時(shí)，需要關(guān)注驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子谅海。RNA聚合酶II啟動(dòng)子（如CMV）驅(qū)動(dòng)編碼蛋白質(zhì)的RNA的表達(dá)脸哀。RNA聚合酶III啟動(dòng)子（如H1或U6）驅(qū)動(dòng)更短的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，如shRNA扭吁。
包膜蛋白
病毒載體可以借助其他病原體的外殼蛋白包裝成假病毒撞蜂，以改變其嗜性。最常用的是皰疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G） 侥袜。其他常見的包膜蛋白來源于狂犬病毒蝌诡、鼠白血病病毒、埃博拉病毒枫吧、桿狀病毒送漠、麻疹病毒和纖絲病毒。桿狀病毒GP64和肝炎E1和E2型假病毒增強(qiáng)肝轉(zhuǎn)導(dǎo)由蘑，纖絲病毒包膜型假病毒增強(qiáng)呼吸道上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)闽寡。有趣的是代兵，假病毒還會(huì)影響狂犬病毒糖蛋白包被的慢病毒的運(yùn)輸，導(dǎo)致軸突逆行運(yùn)輸 [12] 爷狈。
- pCMV-VSV-G含有在CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)皰疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)的基因序列植影，這個(gè)基因用于代替原病毒中編碼病毒包膜蛋白的基因，可以大幅提高病毒的宿主細(xì)胞范圍涎永。
注意：由于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒gag思币、pol和env基因間的亞型差異，轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒不能夠互換羡微。
該系統(tǒng)中還增加了兩個(gè)元件谷饿，分別為來源于旱獺肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element, WPRE）和來源于HIV1整合酶基因的central Polypurine Tract（cPPT），WPRE有利于增加蛋白的表達(dá)量妈倔，而cPPT元件則有利于增加病毒的滴度博投，WPRE和cPPT元件能使蛋白的表達(dá)量至少提高4倍。
助轉(zhuǎn)染試劑：（Ploybrene的選擇）
Ploybrene是帶正電的小分子盯蝴，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合毅哗，提高慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，通常加入polybrene感染效率可以提高2-10倍捧挺。Polybrene有一定的細(xì)毒性虑绵，有的細(xì)胞對(duì)polybrene的毒理反應(yīng)明顯，因此細(xì)胞感染時(shí)是否適合polybrene需要摸索闽烙；不同細(xì)胞對(duì)polybrene的敏感度不同翅睛，可以用1-10ug/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h內(nèi)細(xì)胞武鳴縣毒性反應(yīng)為最佳黑竞，可參考文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索宏所，polybrene最常用的工作濃度6-8ug/ml。
- 第二代包裝系統(tǒng)
這個(gè)系統(tǒng)含有3個(gè)質(zhì)粒摊溶，第1個(gè)質(zhì)粒：包裝質(zhì)粒爬骤，它編碼Gag，PoI莫换，Rev與Tat基因霞玄。第2個(gè)質(zhì)粒：包膜質(zhì)粒，含有VSV-G拉岁，編碼蛋白Env坷剧。第3個(gè)質(zhì)粒：目的質(zhì)粒，含有病毒的LTRs和psi包裝信號(hào)（圖片未畫出）喊暖，除非有內(nèi)部啟動(dòng)子惫企，否則這個(gè)目的質(zhì)粒的目的基因是由5'LTR驅(qū)動(dòng)的，它是一個(gè)弱啟動(dòng)子，需要Tat元件 的來激活它狞尔。所有的第2代慢病毒目的質(zhì)粒必須要用第2代慢病毒包裝系統(tǒng)丛版，因此它的LTR是Tat依賴性的。 - 第三代包裝系統(tǒng)：
設(shè)計(jì)第3代病毒的目的主要還是提高安全性偏序。在第3代病毒中页畦，將第2代病毒的包裝質(zhì)粒分成了2個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)編碼Rev研儒，另外一個(gè)編碼Gag和PoI豫缨。雖然第3代病毒更加安全了，但是它的效率卻降低了端朵。除此之外好芭，第3代病毒刪除了Tat元件，并且在目的質(zhì)粒中引入了一個(gè)嵌合了5'LTR的異源啟動(dòng)子冲呢。這種目的質(zhì)辽岚埽基因的啟動(dòng)子并不依賴于Tat元件。第3代病毒的目的質(zhì)镣胗玻可以使用第2代或第3代的包裝質(zhì)粒瓤湘，也就是說第3代慢病毒的目的質(zhì)粒兼容第2代的包裝系統(tǒng)瓢颅。
參考：https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/
