《癌生物學(xué)》第八章 （1）細(xì)胞周期控制時(shí)鐘

細(xì)胞周期時(shí)鐘是一些相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)粤咪，它們接收胞內(nèi)和胞外的各種不同來源的信號，對其進(jìn)行整合后決定細(xì)胞的命運(yùn)描沟。

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細(xì)胞周期

G0期贯被，非生長狀態(tài)；G1期咳胃，DNA 復(fù)制植康；S期， DNA合成展懈；G2期销睁，3-5h供璧，為M期和細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備；M期冻记，前期睡毒、中期、后期冗栗、末期演顾，最終完成胞質(zhì)分裂，形成兩個(gè)新的子代細(xì)胞贞瞒。

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細(xì)胞周期中每一步的執(zhí)行都有可能發(fā)生故障偶房，細(xì)胞需要具有一系列的監(jiān)控機(jī)制來監(jiān)督細(xì)胞周期每一步的正確，只有在上一步成功完成之后細(xì)胞周期才能進(jìn)入下一步军浆。如果細(xì)胞周期中特定的步驟發(fā)生錯(cuò)誤，監(jiān)控機(jī)制就會馬上中止細(xì)胞周期的進(jìn)程挡闰，直到這個(gè)錯(cuò)誤被修正乒融。還有的監(jiān)控機(jī)制用于確保某些特定的步驟在一個(gè)細(xì)胞周期中完成后就不再重復(fù)，直到細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期摄悯，這些監(jiān)控機(jī)制被命名為檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint) 或檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控 (checkpoint control)赞季。

G1 期特定時(shí)相決定細(xì)胞生長/維持靜止

（1）受控于其周圍的胞外環(huán)境；
（2）受控于活躍細(xì)胞周期的特定時(shí)間窗內(nèi)的生長調(diào)控信號奢驯，具體來說申钩，活躍細(xì)胞周期的
特定時(shí)間窗內(nèi)是指從 G1 期開始直至 G1/S 期轉(zhuǎn)換前的 1h 或 2h；
G1期是細(xì)胞對有絲分裂原生長因子和TGF-b敏感的時(shí)象瘪阁，G1期關(guān)鍵的轉(zhuǎn)換點(diǎn)稱為檢驗(yàn)點(diǎn)或者R點(diǎn)撒遣。R點(diǎn)是決定細(xì)胞是否生長的關(guān)鍵決策點(diǎn)，此外G1晚期的其他決策點(diǎn)仍然對一些腫瘤細(xì)胞的異常增殖發(fā)揮作用管跺。

細(xì)胞周期時(shí)鐘的核心組件

本質(zhì)為相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)义黎，最核心的為細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)，CDK不能依靠自身發(fā)揮作用豁跑，而必須與細(xì)胞周期蛋白相互結(jié)合才能發(fā)揮正常功能廉涕。CDK 與其相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白配體構(gòu)成雙分子復(fù)合體參與細(xì)胞周期時(shí)鐘的信號向下游傳遞給效應(yīng)分子，推動細(xì)胞生長-分裂周期的運(yùn)行艇拍。
CDK 是絲氨酸/蘇氨酸激酶狐蜕。細(xì)胞周期蛋白與 CDK 的結(jié)合激活了激酶的催化活性。

CDK 與 cyclin 在細(xì)胞周期中的作用：
① 在 G1 期的大部分時(shí)間段內(nèi)卸夕，兩個(gè)功能類似的 CDK(CDK4 和 CDK6)與 3個(gè) cyclin (D1层释、D2、D3) 相互作用并由其定位至相應(yīng)部位娇哆，這 3 個(gè)cyclin 統(tǒng)稱為 D 型細(xì)胞周期蛋白湃累。
② G1 期晚期的 R 點(diǎn)之后勃救，E 型細(xì)胞周期蛋白 (E1、E2) 與 CDK2 結(jié)合并磷酸化是進(jìn)入 S 期所需的適當(dāng)?shù)孜铩?br> ③ 隨著細(xì)胞進(jìn)入 S 期治力，A 型周期蛋白 (A1 和 A2) 代替 E 型細(xì)胞周期蛋白與CDK2 結(jié)合蒙秒，從而保證 S 期的進(jìn)程。
④S 后期宵统，A 型細(xì)胞周期蛋白與 CDK2 解離并重新結(jié)合其他 CDK, 此復(fù)合體被稱為 CDC2 或者 CDK1(本書用 CDC2) 晕讲。
⑤ 進(jìn)入 G2 期后，CDC2 中的 A 型細(xì)胞周期蛋白被 B 型細(xì)胞周期蛋白(B1 和B2) 所替代马澈。最終瓢省，從 M 期開始，B 型細(xì)胞周期蛋白參與的 CDC2 復(fù)合體觸發(fā)了有絲分裂復(fù)雜過程的前期痊班、中期勤婚、后期、末期等許多事件涤伐。
⑥ 另一對 cyclin-CDK 復(fù)合體——cyclin C-CDK3 參與了細(xì)胞從 G0 期進(jìn)入G1 期的轉(zhuǎn)換馒胆，目前對其知之甚少。

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各種 cyclin-CDK 復(fù)合體的激活是可以調(diào)節(jié)的以強(qiáng)化對細(xì)胞周期特定時(shí)相的調(diào)控 凝果。其中最重要的調(diào)控手段就是改變細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相中細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平和效率 祝迂。但幾乎所有的 CDK 表達(dá)水平變化很小。各種細(xì)胞周期蛋白隨著細(xì)胞周期時(shí)相的變化而快速地改變器净，是因?yàn)樗鼈兡軌?br> 被快速降解型雳，其降解主要是通過泛素化途徑進(jìn)行的。但cyclinD主要受控于細(xì)胞外信號山害。
CDK4 和CDK6 功能相似纠俭，此后就用 CDK4/6 指代。cyclinD-CDK4/6 復(fù)合體具有相同的酶活性和底物特異性粗恢，與 cyclinD 的亞型無關(guān)（不論 D1柑晒、D2、D3)眷射。這 3 個(gè)編碼基因的各自啟動子受不同的信號通路調(diào)控匙赞，因此他們的表達(dá)受不同的細(xì)胞表面受體調(diào)控。

1. cyclinD1 的啟動子（在人類中通常指 CCND1) 具有 AP-1妖碉、Tcf/Lef 和 NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合點(diǎn), 它們能依次被多種生長因子受體激活涌庭；
2. cyclinD2 的啟動子與 Myc 的活化及胞外信號導(dǎo)致的胞內(nèi) cAMP 累積相關(guān)；
3. cyclinD3 與轉(zhuǎn)錄因子STAT3 和 STAT5 相關(guān)欧宜，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與由白細(xì)胞介素受體介導(dǎo)的多種造血細(xì)胞活化坐榆，而參與激活淋巴細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子 E2A 也能調(diào)控 cyclinD3 的表達(dá)。
   cyclinD-CDK4/6 復(fù)合體形成冗茸，它們將使細(xì)胞從 G1 期開始通過 R 點(diǎn)席镀。一旦細(xì)胞通過 R 點(diǎn)匹中，細(xì)胞周期將會自主進(jìn)行，不受細(xì)胞外信號的影響

CDK抑制劑

還存在其他層面的方式調(diào)控細(xì)胞周期蛋白-CDK 復(fù)合體的活化豪诲。在這些調(diào)控方式中最重要的方式來源于一類蛋白顶捷，即 CDK 抑制分子或稱為 CKIs。

1. 4 個(gè) INK4 家族的分子（起先被命名為 CDK4 抑制分子）屎篱，能定向結(jié)合 CDK4 和 CDK6 復(fù)合體 服赎，而對 CDC2 和 CDK2 不起作用。這 4 種抑制分子包括 p16INK4A交播、p15INK4B重虑、p18lNK4C和 p19INK4D。

2. 另外 3 個(gè)抑制分子是 p21Cip1(有時(shí)也稱為p21Waf1)秦士、 p27Kip1缺厉、p57Kip2, 它們對細(xì)胞周期晚期存在的細(xì)胞周期蛋白-CDK 復(fù)合體具有廣泛的抑制作用

   
   
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3. TGF-β 能強(qiáng)烈誘導(dǎo) p15INK4B 的表達(dá)，并且對 p21Cip1 也有一定的誘導(dǎo)作用隧土，其中芽死，前者能夠阻斷 cyclinD-CDK4/6 的反應(yīng)，后者能夠影響細(xì)胞周期中其他 cyclin-CDK 復(fù)合體的活化次洼。如果沒有活化的 cyclinD-CDK4/6, 細(xì)胞將不能通過 G1 早期和中期到達(dá) R 點(diǎn)。一旦細(xì)胞通過了 R 點(diǎn)遇骑，細(xì)胞將不再依賴 cyclinD-CDK4/6 的作用卖毁。這或許可以解釋為什么 TGF-β 在 G1 早期和中期只有生長抑制作用，而當(dāng)細(xì)胞通過 R 點(diǎn)后其生長抑制作用將部分甚至全部喪失落萎。

4. p21Cip1是一種廣泛的 CDK 抑制分子亥啦，能夠被 TGF-β 誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)作用較弱练链。各種生理性應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致 p21Cip1水平升高翔脱，所有應(yīng)激中最嚴(yán)重的是細(xì)胞基因組的損傷。在基因組 DNA 持續(xù)非修復(fù)狀態(tài)的悄況下媒鼓，DNA 一旦受到損傷届吁，只要基因組還處在未修復(fù)狀態(tài)，被誘導(dǎo)表達(dá)的 p21Cip1 將降低已經(jīng)形成的 cyclin-CDK 復(fù)合體的活性绿鸣，如 cyclinE-CDK2疚沐、cyclinA-CDK2、cyclinA-CDC2潮模、cyclinB-CDC2亮蛔。一旦 DNA 的損傷被修復(fù)，p21Cip1 的阻斷作用就被解除擎厢。如果這一時(shí)期細(xì)胞的基因組被誘變劑損傷究流，p21Cip1 將阻止細(xì)胞通過 R 點(diǎn)（通過抑制細(xì)胞周期蛋白 E-CDK2 復(fù)合體）辣吃，以保證細(xì)胞不能進(jìn)入 S 期，直至 DNA 損傷被修復(fù)芬探，使得受損的 DNA 序列不會被復(fù)制神得。而且p21Cip1 能抑制一種被稱為 PCNA 的 DNA 復(fù)制關(guān)鍵組件的功能，這一功能能夠保證已經(jīng)開始的 DNA 復(fù)制的中止灯节， 直到 DNA 損傷修復(fù)完成循头。

   
   
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促細(xì)胞分裂劑能夠發(fā)揮與 CDK 抑制分子相反的作用，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程炎疆。它們的作用機(jī)制是依靠 PI3K 通路卡骂。PI3K 能直接或間接地被促細(xì)胞分裂劑激活，進(jìn)而激發(fā)許多酪氨酸激酶受體形入，其中就包括Akt/PKB全跨，而Akt/PKB 是一種重要的激酶。既而 Akt/PKB 能磷酸化位于細(xì)胞核中的 p21Cip1亿遂，促進(jìn)其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)全細(xì)胞質(zhì)浓若，而到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中的 p21Cip1將不能對細(xì)胞周期蛋白-CDK 復(fù)合體產(chǎn)生抑制作用。同樣蛇数，Akt/PKB 能夠磷酸化 p27Kip1(其功能與 p21Cip1 類似）挪钓，并抑制 p27Kip1 從其合成的細(xì)胞質(zhì)部位轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，而p27Kip1通常在細(xì)胞核中才能發(fā)揮其關(guān)鍵作用耳舅。

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p21Cip1與 p27Kip1存在一種看似很矛盾生物學(xué)行為碌上，當(dāng)它們抑制 cyclinE-CDK2、cyclinA-CDC2浦徊、cyclinB-CDC2 作用的同時(shí)馏予，其又促進(jìn)了 cyclinD-CDK4/6 復(fù)合體的形成。因此盔性，"CDK 抑制分子” 實(shí)際上是一個(gè)誤稱 霞丧。這兩個(gè)蛋白質(zhì) p21Cip1 與 p27Kip1 對大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合體具有抑制作用，但是它們對 cyclinD-CDK4/6 具有激活作用冕香。

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細(xì)胞從G1期跨越R點(diǎn)到S期的機(jī)制：

當(dāng)細(xì)胞處在 G1 期時(shí)蛹尝，p27Kip1累積并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)為數(shù)不多的 cyclinE-CDK2, 這種結(jié)合能抑制復(fù)合體的活性。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子的作用時(shí)暂筝，由于促細(xì)胞分裂劑能夠提高細(xì)胞中 D 型周期素的水平箩言，cyclinD-CDK4/6 開始累積。每當(dāng)新的cyclinD-CDK4/6 復(fù)合體形成時(shí)焕襟，它就會結(jié)合一個(gè) p27Kip1 分子陨收。隨著越來越多p27Kip1 被 cyclinD-CDK4/6 復(fù)合體捕獲，導(dǎo)致細(xì)胞中游離的 p27Kip1 減少。幾小時(shí)后务漩，剩余的 p27Kip1分子終于從 cyclinE-CDK2 復(fù)合體上解離拄衰。一旦 cyclinE-CDK2復(fù)合體解除了 p27Kip1 的抑制作用，該復(fù)合體就能推進(jìn)細(xì)胞通過 R 點(diǎn)饵骨。最初被激活的cyclinE-CDK2 復(fù)合物觸發(fā)了一個(gè)自我維持的正反饋循環(huán)翘悉，導(dǎo)致 p27Kip1分子發(fā)生降解，同時(shí)增加新的 cyclinE 的分子合成居触。結(jié)果是功能性 cyclinE-CDK2 復(fù)合物迅速上升以及基本不可逆地通過 R 點(diǎn)妖混。

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《癌生物學(xué)》第八章（2）pRb 在細(xì)胞周期時(shí)鐘中的作用

01 pRb 在細(xì)胞周期中的變化

pRb 的磷酸化與細(xì)胞周期的進(jìn)程相一致。

1. 在 G0 期轮洋，pRb 基本是非磷酸化狀態(tài)制市；進(jìn)入 G1 期后，pRb 上少量的絲氨酸/蘇氨酸殘基開始磷酸化（低磷酸化）弊予；細(xì)胞通過 R 點(diǎn)后祥楣，pRb 上大量的絲氨酸/蘇氨酸殘基被磷酸化（高度磷酸化）绒窑。一旦細(xì)胞通過 R 點(diǎn)镐牺，pRb 在隨后的整個(gè)細(xì)胞周期中就會持續(xù)維持磷酸化狀態(tài)杨何；在細(xì)胞完成有絲分裂后灿意，pRb 上的磷酸化基團(tuán)被 I 型蛋白磷酸酯酶 (PPl) 水解去除。這些磷酸基團(tuán)的水解是下一個(gè)細(xì)胞周期的必需階段起暮，由此售躁，pRb 開始進(jìn)入下一個(gè)磷酸化循環(huán)价匠。pRb 的高度磷酸化與細(xì)胞通過 R 點(diǎn)的時(shí)間相一致正塌，提示pRb可能是 R 點(diǎn)轉(zhuǎn)換的分子調(diào)節(jié)器渡八。

2. 在 G1 早期和中期的 pRb 是低磷酸化狀態(tài)的，它對細(xì)胞的生長起抑制作用传货。而在 R 點(diǎn)之后，pRb 是高度磷酸化狀態(tài)宏娄，它喪失了生長抑制功能问裕，即蛋白質(zhì)的磷酸化使其功能失活。
   3.pRb 的磷酸化是可逆的過程孵坚。如果細(xì)胞在 S 期或 G2 期受到生理性應(yīng)激粮宛，包括缺氧、DNA 損傷卖宠、有絲分裂紡錘體被破壞等巍杈，磷酸化的 pRb 可以被目前尚未知的磷酸酶水解，使 pRb 回到抑制生長的狀態(tài)扛伍。一旦細(xì)胞生理應(yīng)激或損傷被解除筷畦，這種反應(yīng)也將被逆轉(zhuǎn)。

   
   
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3. 除了 pRb，能夠與這些 DNA 腫瘤病毒編碼蛋白結(jié)合的還有 pRb 的兩個(gè)同源蛋白——p107 和 p130鳖宾。pRb 吼砂、p107 和 p130常常被稱為“口袋蛋白“，因?yàn)槊總€(gè)蛋白質(zhì)攜帶一個(gè)可被病毒癌基因如 E1A 插入的溝槽鼎文。E1A 蛋白可以結(jié)合這 3 種細(xì)胞蛋白渔肩，并且明顯是為了將這三種蛋白捕獲隔離。一個(gè)病毒感染細(xì)胞后需要重置被感染細(xì)胞的調(diào)控通路拇惋，從而創(chuàng)建一個(gè)支持病毒復(fù)制各個(gè)步驟的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境周偎。因?yàn)椴《?DNA 復(fù)制是最重要的環(huán)節(jié)，病毒只有把這些控制細(xì)胞處于靜息期的
   調(diào)控蛋白功能失活撑帖，使受感染的細(xì)胞從 G0 靜息靜釋放進(jìn)入活躍的細(xì)胞周期蓉坎，DNA才能有效復(fù)制。此外磷仰，HPV E7 蛋白不僅能直接阻斷（抑制） pRb 功能袍嬉，還能介導(dǎo) pRb 的泛素化從而促進(jìn)其降解。
   4.DNA 腫瘤病毒編碼蛋白能夠優(yōu)先結(jié)合低磷酸化的 pRb, 而這種低磷酸化的 pRb 主要出現(xiàn)在 G1 期灶平。但這些病毒編碼癌蛋白不能結(jié)合 G1 晚期及隨后的細(xì)胞周期中出現(xiàn)的高度磷酸化 pRb伺通。這一發(fā)現(xiàn)也提示，腫瘤病毒編碼蛋白的主要作用于特定狀態(tài)下的 pRb 存在于 G1 早期和中期的逢享、起生長抑制作用的 pRb, 對那些已經(jīng)被其他途徑失活的 pRb 蛋白則不起作用罐监。

02 pRb 磷酸化狀態(tài)的調(diào)控

1. 在 G1 早期和中期，cyclinD 與其配體 CDK4/6 參與 pRb 的起始磷酸化瞒爬，并產(chǎn)生低磷酸化的 pRb 蛋白弓柱。故而我們能歸納出這樣一條信號通路：生長因子誘導(dǎo) cyclinD 的表達(dá)；細(xì)胞周期蛋白 D 與 CDK4/6 相互結(jié)合侧但，開始 pRb 的磷酸化過程矢空。

2. cyclinE 的表達(dá)水平在 R 點(diǎn)顯著升高，其與配體 CDK2 相互作用能促進(jìn) pRb 磷酸化的完成禀横，使 pRb 進(jìn)入高度磷酸化狀態(tài)屁药。而功能失活不經(jīng)過 cyclinD-CDK4/6的起始磷酸化的 pRb 將不能成為 cyclinE-CDK2 復(fù)合體的磷酸化底物，pRb 的同源蛋白 p107 和 p130 的磷酸化和功能失活也在 cyclinD-CDK4/6 的調(diào)控之下柏锄，其中或許還包括 cyclinE-CDK2 復(fù)合體的作用酿箭。

   
   
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3. 如果在從 G1 早期到 R 點(diǎn)的時(shí)間段內(nèi)撤除促細(xì)胞分裂劑，cyclinD1 的表達(dá)水平將大幅度下降趾娃。沒有 cyclinD1 的情況下缭嫡，pRb 通過尚未知的磷酸酯酶去除其磷酸基團(tuán)，結(jié)果可能導(dǎo)致 pRb 蛋白不能成為 cyclinE-CDK2 的磷酸化底物抬闷。這一反應(yīng)強(qiáng)調(diào)了在 G1 早期到 R 點(diǎn)的時(shí)間段內(nèi)持續(xù)較強(qiáng)促細(xì)胞分裂信號作用的必需性妇蛀。
4. 細(xì)胞一旦通過 R 點(diǎn)，pRb 的高度磷酸化及功能失活狀態(tài)的維持和加強(qiáng)就主要通過 cyclinE、cyclinA讥耗、cyclinB 及其各自相關(guān)的 CDK 來調(diào)控有勾。這些細(xì)胞周期蛋白-CDK 復(fù)合體都不參與細(xì)胞外信號反應(yīng)，這是細(xì)胞周期時(shí)鐘的特征古程。
5. 如果 pRb 在細(xì)胞中缺失（通過染色體上 Rb 基因突變蔼卡、Rb 基因啟動子甲基化，或者 DNA 腫瘤病毒編碼蛋白的作用）挣磨，那么該蛋白將不再能監(jiān)控 R 點(diǎn)雇逞。而在其他一些腫瘤細(xì)胞中，則失去了正常情況下 PPl 磷酸酯酶完成的 M/G1 期轉(zhuǎn)換所必需的 pRb 去磷酸化過程茁裙。這一現(xiàn)象導(dǎo)致 pRb 持續(xù)磷酸化塘砸，在細(xì)胞的整個(gè)生長分裂周期內(nèi)始終處于功能失活狀態(tài)（功能為抑制） 。沒有 pRb 的監(jiān)控作用晤锥，細(xì)胞通過 G1 期進(jìn)入 S 期將不受控制掉蔬。

03 pRb 在細(xì)胞周期中的下游機(jī)制

1.當(dāng) pRb(及其同源蛋白 p107 和 p130，共稱 “口袋蛋白”) 處于非磷酸化或低磷酸化狀態(tài)時(shí)矾瘾，它們能結(jié)合 E2F, 包括與 DNA 結(jié)合的 E2F; 然而女轿，當(dāng)被高度磷酸化后，pRb 和它的同源蛋白從 E2F 上解離壕翩。這提示著：
① 在 G1 早期和中期蛉迹，E2F 結(jié)合在它們調(diào)控基因的啟動子上；同時(shí)放妈，這些轉(zhuǎn)錄因子與口袋蛋白結(jié)合北救；口袋蛋白參與抑制 E2F 的轉(zhuǎn)錄激活作用，故在細(xì)胞周期的 G1 期依靠 E2F 轉(zhuǎn)錄的基因處于抑制狀態(tài)芜抒；
② 當(dāng)口袋蛋白在 G1 晚期的點(diǎn)被高度磷酸化后珍策，它們與 E2F 解離，允許 E2F激活下游基因的轉(zhuǎn)錄宅倒，這些基因的蛋白產(chǎn)物隨后誘導(dǎo)細(xì)胞從 G1 晚期進(jìn)入 S 期膛壹；
③ 當(dāng)存在病毒來源的癌蛋白時(shí)，它們能通過阻止 pRb 與 E2F 的結(jié)合產(chǎn)生與pRb 高度磷酸化同樣的后果唉堪。

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2. E2F 由 E2F1~E2F8 八個(gè)成分組成 ，其中前 6 個(gè)可以和 DP1 或 DP2 結(jié)合形成異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子; E2F7 和 E2F8 有兩個(gè) DNA 結(jié)合位點(diǎn)(DBD), 可以和 DNA結(jié)合肩民，但和 DP1 或 DP2 亞基無關(guān)唠亚。E2F-DP 二聚體就會識別結(jié)合許多基因啟動序列中的特異序列元件(TTTCCCGC 或此序列的輕度變異體）。當(dāng) E2F 結(jié)合基因啟動序列而缺乏任何相關(guān)口袋蛋白（如 pRb持痰、p107灶搜、p130) 時(shí)，E2F (如 E2F1、E2F2割卖、E2F3) 可以吸引其他蛋白（如組蛋白乙跚澳穑化酶），使臨近染色質(zhì)重塑并募集 RNA 聚合酶以起始轉(zhuǎn)錄鹏溯。

   
   
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3. 當(dāng) pRb 呈低磷酸化狀態(tài)時(shí)罢维，它能夠與已經(jīng)位于基因啟動子區(qū)的 E2F1/2/3 結(jié)合（此時(shí) E2F 與多個(gè)基因的啟動子結(jié)合，pRb 與它們結(jié)合后也依然能保待這種結(jié)合的形式）丙挽。一旦與這些 E2F 結(jié)合肺孵，低磷酸化的 pRb 分子能夠封閉 E2F 上的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域。同時(shí)颜阐，pRb 募集其他抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白平窘。其中重要的途徑之一是募集組蛋白去乙酰化酶 (histone deacety lase,HDAC)到復(fù)合體上凳怨；HDAC 通過水解附近組蛋白分子上的乙豕逅遥基團(tuán)，導(dǎo)致染色體構(gòu)型重塑使之不適應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活肤舞。這意味著紫新，除了通過物理性結(jié)合阻斷與 E2F 的反式激活結(jié)構(gòu)域，pRb 還發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用萨赁。

   
   
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4. E2F4 和 E2F5 主要參與抑制基因表達(dá)弊琴，它們通過與 p107 和 p130 蛋白共同作用募集轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合到啟動子區(qū)域，使基因表達(dá)下調(diào)杖爽。E2F6敲董、E2F7 和 E2F8 不與口袋蛋白結(jié)合，能單獨(dú)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用慰安。

   
   
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   細(xì)胞周期時(shí)鐘中的正反饋回路：
   ① 在 E2F 激活的基因中最顯著的是編碼 cyclinE 和 E2F1 的基因腋寨。因此，通過 R 點(diǎn)以后 cyclinE 和 E2F1 的 mRNA 水平迅速上調(diào)化焕，蛋白含量也隨之增加萄窜。因?yàn)椴糠?cyclinE 能與 CDK2 作用共同促進(jìn) pRb 的高度磷酸化，所以 pRb 的失活將引起 cyclinE 水平的上調(diào)撒桨，而 cyclinE 一旦生成查刻，將進(jìn)一步使 pRb 失活。

   
   
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   ② cyclinE-CDK2 復(fù)合體使 p27Kip1 磷酸化凤类，后者一經(jīng)磷酸化后就迅速發(fā)生泛素化降解 穗泵。p27Kip1 分子降解后將釋放 cyclinE-CDK2 復(fù)合體，進(jìn)而繼續(xù)磷酸化其他的p27Kip1分子使其失活谜疤。
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   ③ E2F 在 R 點(diǎn)可提高 Skp2 基因的轉(zhuǎn)錄佃延，Skp2 蛋白能促進(jìn) p27Kip1降解现诀，從而釋放更多被 p27Kip1抑制的 cyclinE-CDK2 復(fù)合體，從而cyclinE-CDK2 復(fù)合體繼續(xù)磷酸化其他的p27Kip1分子使其失活履肃。

E2F1仔沿、E2F2 和 E2F3 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活化的時(shí)期是非常短暫的。這段時(shí)間始于 R 點(diǎn)尺棋，此時(shí) pRb 發(fā)生高度磷酸化并釋放 E2F封锉。這 3 個(gè) E2F 進(jìn)而誘導(dǎo) G1 晚期重要基因表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物將為細(xì)胞進(jìn)入 S 期做準(zhǔn)備陡鹃。
當(dāng)細(xì)胞通過 G1/S 過渡期進(jìn)入 S期時(shí)烘浦，cyclinA 被激活并與其配體 CDK2 共同磷酸化這些異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子 E2F和 DP 的亞基，導(dǎo)致 E2F-DP 復(fù)合物解離萍鲸，并喪失其轉(zhuǎn)錄激活能力闷叉。同時(shí)，E2F1 (可能還包含其他 E2F) 發(fā)生泛素化降解脊阴；具有抑制 E2F 介導(dǎo)的基因活化能力的E2F7 和 E2F8 開始表達(dá)握侧，使細(xì)胞進(jìn)入 S 期后的基因表達(dá)不再依賴 E2F。這些改變能有效關(guān)閉 E2F 因子的轉(zhuǎn)錄激活作用嘿期，而 E2F 作為轉(zhuǎn)錄激活因子的短暫作用時(shí)刻僅會在下一次細(xì)胞周期的 G1 末期重新出現(xiàn)品擎。

04 多種有絲分裂信號通路調(diào)控 pRb 的磷酸化狀態(tài)

有絲分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過 Ras 使 pRb 先低磷酸化最終高度磷酸化。這種磷酸化作用的啟動是通過誘導(dǎo)編碼 cyclinD 基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)备徐。當(dāng) Ras 信號途徑被阻斷（通過轉(zhuǎn)入顯性負(fù)效應(yīng)突變體 Ras 蛋白）后萄传，血清培養(yǎng)的野生型細(xì)胞的增殖被阻斷，而缺乏 Ras 作用的突變型 Rb-/-細(xì)胞則能照常進(jìn)入S 期蜜猾。這說明了在 G1 期間 Ras 的主要功能是確保配體激活的生長因子受體能成功引發(fā) pRb 磷酸化及功能失活秀菱，進(jìn)而產(chǎn)生有絲分裂信號釋放。此外蹭睡，外源過表達(dá)cyclinE 或 E2F1 能夠繞過顯性負(fù)效應(yīng)的 Ras 蛋白衍菱，引起的 S 期前阻滯。上述內(nèi)容揭示了一條直線指令：生長因子→生長因子受體→Ras→cyclinD1 和 cyclinE→pRb失活→E2F 活化→進(jìn)入 S 期肩豁。

1. Ras→Raf→MAPK 信號通路：處于這一信號級聯(lián)放大的底層有許多 Fos 家族轉(zhuǎn)錄因子脊串，能與 Jun 蛋白形成復(fù)合物，產(chǎn)生異二聚體 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子清钥，這些 AP-1 復(fù)合物已知是 cyclinD1 基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)力激活因子琼锋，

2. 活化后的 Ras 通過磷脂酰肌醇 3-激酶(Pl3K)激活 Akt/PKB 激酶，后者能使糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)磷酸化失活祟昭，該反應(yīng)利于細(xì)胞生長缕坎。GSK-3β 的作用是使 β-catenin 磷酸化，最終導(dǎo)致 β-catenin 泛素化从橘，并隨后在蛋白酶體內(nèi)降解念赶。然而，PKB/Akt 磷酸化使 GSK-3β 失活恰力，導(dǎo)致 β-catenin 積累并入核叉谜，在核內(nèi)與Tcf/Lef 形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，促進(jìn)合成更多 cyclinD1 的mRNA踩萎。

   
   
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《癌生物學(xué)》第八章（3）Myc停局、TGF-β 在細(xì)胞周期時(shí)鐘中的作用

01 Myc 蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖或分化的方向

1. Myc 蛋白在調(diào)節(jié)異常的情況下會成為一種癌蛋白。超過 70% 的人類腫瘤中過度表達(dá) Myc (通常稱為 c-Myc), 或者與其相近的兩個(gè)同源蛋白 N-Myc 和 L-Myc香府。Myc 癌蛋白家族的功能與我們前面提到的癌蛋白非常不同董栽。其他癌蛋白特別是 Ras 和 Src, 在細(xì)胞膜附近作用并引發(fā)復(fù)雜的級聯(lián)信號，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白企孩，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子锭碳。相比之下，Myc 和它的同源蛋白存在于核內(nèi)勿璃，并發(fā)揮促生長轉(zhuǎn)錄因子的功能擒抛。
2. 這 3 個(gè) Myc 家族蛋白屬于一個(gè)龐大（多于 100 個(gè)成員）的 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族。它們以共同的三維結(jié)構(gòu)命名补疑。這個(gè)三維結(jié)構(gòu)包括一個(gè)堿性的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域歧沪，以及與之相連的一個(gè)由氨基酸序列構(gòu)成的 a 螺旋-環(huán)狀結(jié)構(gòu)-a 螺旋結(jié)構(gòu)。該轉(zhuǎn)錄因子家族成員能與自身或者其他成員形成同源或者異源二聚體莲组。這類二聚體復(fù)合物隨后與被稱為E-box(由CACGTG 序列組成）的特異性調(diào)控序列所結(jié)合诊胞，E-box 序列存在于其調(diào)控的目的基因的啟動子區(qū)域。
3. Myc 作為轉(zhuǎn)錄因子是起促進(jìn)作用還是抑制作用锹杈，不僅僅只由它自身水平?jīng)Q定撵孤，還由與它結(jié)合的 bHLH 蛋白水平?jīng)Q定。后者能夠增強(qiáng)或者抑制 Myc 作為轉(zhuǎn)錄激活因子的功能嬉橙。Myc 蛋白的磷酸化能調(diào)節(jié)它的功能及穩(wěn)定性早直，當(dāng) Myc 與能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活的 bHLH 配體 Max 結(jié)合后，Myc-Max 異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子將有效地促進(jìn)一群目的基因表達(dá)市框，其中許多基因的產(chǎn)物對細(xì)胞周期具有潛在的促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)霞扬。

4. Myc 作為轉(zhuǎn)錄因子的功能比較特殊。其他的轉(zhuǎn)錄因子可能僅參與轉(zhuǎn)錄起始枫振。但是喻圃，對于許多基因來說，RNA 聚合酶 II 開始轉(zhuǎn)錄后粪滤，會在一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下方約 50bp 處的位點(diǎn)暫停斧拍。此時(shí)，Myc-Max 異源二聚體結(jié)合到 DNA 上杖小，與 RNA 聚合酶 II 復(fù)合物發(fā)生作用肆汹，使其通過暫停位點(diǎn)愚墓，并繼續(xù)轉(zhuǎn)錄整個(gè)基因，即延伸 RNA 轉(zhuǎn)錄物昂勉。如果沒有 Myc-Max 的作用浪册，RNA 聚合酶 II 將停止在該暫停位點(diǎn)。70%活躍轉(zhuǎn)錄的基因在這些暫停位點(diǎn)中都有 Myc-Max 異源二聚體結(jié)合岗照。
   5.當(dāng)活躍生長的細(xì)胞還沒有進(jìn)入有絲分裂后期的分化狀態(tài)時(shí)村象，Myc 可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并阻斷細(xì)胞分化。當(dāng)細(xì)胞增殖減緩并開始分化時(shí)攒至，因?yàn)?Mxd 蛋白水平升高厚者，替代了復(fù)合物中的 Myc, Myc-Max 復(fù)合物解離。后來形成的 Mxd-Max 復(fù)合物不再刺激轉(zhuǎn)錄迫吐，使許多人體組織細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期的分化狀態(tài)库菲。

   
   
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