寫(xiě)在前面
- 以下內(nèi)容均來(lái)自我在菲沙基因（Frasergen）暑期生信培訓(xùn)班上記錄的課堂筆記
1.基因組概念
- 基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。即核基因組是單倍體細(xì)胞核內(nèi)的全部DNA分子;線粒體基因組則是一個(gè)線粒體所包含的全部DNA分子 ;葉綠體基因組則是一個(gè)葉綠體所包含的全部DNA分子揭保。
2.三代PacBio數(shù)據(jù)準(zhǔn)備
2.1 數(shù)據(jù)格式
- Pacbio平臺(tái)測(cè)序出來(lái)的reads肥橙，由接頭序列, 條碼序列, 插入序列間隔線性分布，即ABIB-ABIB—ABIB-ABIB—(A: adapter, B: barcode, I: insert)
├── Sample
│ └── Library（不分文庫(kù)時(shí)文庫(kù)名為 all）
│ └── Cell
│ ├── *.subreads.bam 用于下游分析的有效數(shù)據(jù)（相當(dāng)于clean data）
│ ├── *.subreads.bam.pbi subreads.bam文件的索引文件
│ └── *.xml 測(cè)序信息記錄文件
2.2 數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換（bam轉(zhuǎn)fq/fa）
- 軟件：bam2fastq
- 使用conda安裝
conda install -c yuxiang bam2fastq -y
- bam 轉(zhuǎn) fastq/ fasta(后綴自動(dòng)補(bǔ)充為.fastq/ fasta)
bam2fastq *subreads.bam –o *subreads.bam -u
bam2fasta *subreads.bam –o *subreads.bam -u
-u：輸出文件不壓縮秸侣。去掉則輸出壓縮文件存筏，由于后續(xù)需要用到非壓縮文件宠互，所以這里加上-u參數(shù)，且節(jié)省時(shí)間
- 數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)（小工具：GNX）
#安裝與編譯
git clone https://github.com/mh11/gnx-tools.git
mkdir bin
javac -d bin/ src/uk/ac/ebi/gnx/*
ant -f package.xml
java -jar gnx.jar
#使用
java -jar gnx.jar all_subreads.bam.fasta > N50
cat N50
3.基因組組裝
3.1 使用Mecat2進(jìn)行基因組組裝
- 軟件介紹
Mecat2軟件介紹
- 使用git安裝并編譯
git clone https://github.com/xiaochuanle/MECAT2.git
cd MECAT2
make
- 新建配置文件config_file.txt
vi config_file.txt
- 填寫(xiě)內(nèi)容如下：
PROJECT=test
RAWREADS= /local_data1/all_subreads.bam.fasta #從bam轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)的fasta文件
GENOME_SIZE= 12251230 #根據(jù)《生信 | 基因組組裝實(shí)戰(zhàn)（三）：Kmer評(píng)估基因組》來(lái)確定
THREADS=15 #線程數(shù)
MIN_READ_LENGTH=2000
CNS_OVLP_OPTIONS="-kmer_size 13"
CNS_PCAN_OPTIONS="-p 100000 -k 100" CNS_OPTIONS=""
CNS_OUTPUT_COVERAGE=30 #根據(jù)菲沙基因老師的經(jīng)驗(yàn)，30-45范圍較好垂涯，可以多次調(diào)整
TRIM_OVLP_OPTIONS="-skip_overhang"
TRIM_PM4_OPTIONS="-p 100000 -k 100"
TRIM_LCR_OPTIONS=""
TRIM_SR_OPTIONS=""
ASM_OVLP_OPTIONS=""
FSA_OL_FILTER_OPTIONS="--max_overhang=-1 --min_identity=-1"
FSA_ASSEMBLE_OPTIONS=""
CLEANUP=0
：以上
前面的內(nèi)容根據(jù)自己的需求修改汁掠，其他默認(rèn)即可
- 保存配置后，運(yùn)行程序
MECAT2/Linux-amd64/bin/mecat.pl correct config_file.txt
MECAT2/Linux-amd64/bin/mecat.pl assemble config_file.txt
-
MECAT2運(yùn)行結(jié)果
【4-fsa】目錄下的【contigs.fasta】為結(jié)果文件
MECAT2運(yùn)行結(jié)果
3.2 使用Flye進(jìn)行基因組組裝
- 軟件簡(jiǎn)介
Flye軟件簡(jiǎn)介
- 使用git安裝并編譯
git clone https://github.com/fenderglass/Flye
cd Flye
make
- 使用方法
Flye/bin/flye \
--pacbio-raw
/local_data1/all_subreads.bam.fasta \
--out-dir test \
--genome-size 12251230 \ #根據(jù)需要請(qǐng)修改
--threads 10
- 結(jié)果文件
Flye結(jié)果文件
3.3 使用wtdbg2進(jìn)行基因組組裝
- 軟件簡(jiǎn)介
wtdbg2軟件簡(jiǎn)介
- 使用git安裝并編譯
git clone https://github.com/ruanjue/wtdbg2
cd wtdbg2
make
- 軟件使用
#quick start with wtdbg2.pl
./wtdbg2.pl -t 16 -x rs -g 12m -o dbg reads.fa
# Step by step commandlines # assemble long reads
./wtdbg2 -x rs -g 4.6m -i reads.fa.gz -t 16 -fo dbg
# derive consensus
./wtpoa-cns -t 16 -i dbg.ctg.lay.gz -fo dbg.raw.fa
# polish consensus, not necessary if you want to polish the assemblies using other tools
minimap2 -t16 -ax map-pb -r2k dbg.raw.fa reads.fa.gz | samtools sort -@4 >dbg.bam
samtools view -F0x900 dbg.bam | ./wtpoa-cns -t 16 -d dbg.raw.fa -i - -fodbg.cns.fa
# Addtional polishment using short reads
bwa index dbg.cns.fa
bwa mem -t 16 dbg.cns.fa sr.1.fa sr.2.fa | samtools sort -O SAM | ./wtpoa-cns -t 16 -x
sam-sr -d dbg.cns.fa -i - -fo dbg.srp.fa
- 結(jié)果文件
wtdbg2結(jié)果文件
3.4 使用Canu進(jìn)行基因組組裝
- 軟件簡(jiǎn)介與原理
Canu運(yùn)行流程
- 使用conda安裝
conda install -c bioconda canu -y
- 軟件使用集币，來(lái)源不同的數(shù)據(jù)使用不同代碼
#For PacBio:
canu -p ecoli -d ecoli-pacbio genomeSize=4.8m -pacbio-raw pacbio.fastq
#For Nanopore:
canu -p ecoli -d ecoli-oxford genomeSize=4.8m -nanopore-raw oxford.fasta
#Assembling PacBio HiFi with HiCanu：
canu -p asm -d ecoli_hifi genomeSize=4.8m -pacbio-hifi ecoli.fastq
#Trio Binning Assembly：
canu -p asm -d ecoliTrio genomeSize=5m \
-haplotype K12 K12.parental.fasta \
-haplotype O157 O157.parental.fasta \
-pacbio-raw F1.fasta
-p 指定輸出前綴
-d 指定輸出結(jié)果目錄
genomeSize 設(shè)置一個(gè)預(yù)估的基因組大小，便于讓Canu估計(jì)測(cè)序深度翠忠，單位是K鞠苟，M，G
maxThreads 設(shè)置最大線程數(shù)
-pacbio-raw 直接測(cè)序得到的原始pacbio數(shù)據(jù)
-pacbio-corrected 經(jīng)過(guò)糾正的pacbio數(shù)據(jù)
-nanopore-raw 原始的nanopore數(shù)據(jù)
-nanopore-corrected 結(jié)果糾正的nanopore數(shù)據(jù)
rawErrorRate 設(shè)置兩個(gè)未糾錯(cuò)read之間最大期望差異堿基數(shù)
correctedErrorRate 設(shè)置糾錯(cuò)后read之間最大期望差異堿基數(shù)
minReadLength 設(shè)置最小使用的reads長(zhǎng)度
minOverlapLength 設(shè)置Overlap的最小長(zhǎng)度
3.5 使用Falcon進(jìn)行基因組組裝
- 軟件組裝原理
falcon軟件組裝原理
- 使用conda安裝軟件
conda install -c conda-forge falcon -y
- 軟件使用秽之，和mecat2一樣当娱，關(guān)鍵就是弄好配置文件。比較好的做法是去官網(wǎng)下載合適的配置文件考榨，然后將其中的某些參數(shù)稍加修改即可跨细。如我下載植物的fc_run_plant.cfg
wget https://pb-falcon.readthedocs.io/en/latest/_downloads/fc_run_plant.cfg
cat fc_run_plant.cfg
[General]
input_fofn = input.fofn
input_type = raw
stop_all_jobs_on_failure = False
length_cutoff = 5000
genome_size = 1400000000
seed_coverage = 30
length_cutoff_pr = 4000
sge_option_da = -pe smp 5 -q bigmem
sge_option_la = -pe smp 20 -q bigmem
sge_option_pda = -pe smp 6 -q bigmem
sge_option_pla = -pe smp 16 -q bigmem
sge_option_fc = -pe smp 24 -q bigmem
sge_option_cns = -pe smp 12 -q bigmem
pa_concurrent_jobs = 96
cns_concurrent_jobs = 96
ovlp_concurrent_jobs = 96
pa_HPCdaligner_option = -v -B128 -M32 -e.70 -l4800 -s100 -k18 -h480 -w8
ovlp_HPCdaligner_option = -v -B128 -M32 -h1024 -e.96 -l2400 -s100 -k18
#下面兩行其中的參數(shù)在下面介紹
pa_DBsplit_option = -a -x500 -s400
ovlp_DBsplit_option = -s400
falcon_sense_option = --output_multi --min_idt 0.70 --min_cov 2 --max_n_read 200 --n_core 8
falcon_sense_skip_contained = True
overlap_filtering_setting = --max_diff 100 --max_cov 100 --min_cov 2 --n_core 12
常規(guī)參數(shù)：
input_fofn = input.fofn 指出所有輸入數(shù)據(jù)，路徑+文件名
input_type = raw （ 或preads ） 標(biāo)明序列類(lèi)型河质，即是否已經(jīng)完成了錯(cuò)誤修正
length_cutoff = 10000 用于錯(cuò)誤修正的種子序列的最低長(zhǎng)度
length_cutoff_pr = 10000 用于構(gòu)建重疊的預(yù)組裝種子序列的最低長(zhǎng)度
b 如果基因組組分有偏好性（例如65% AT rich）應(yīng)該設(shè)置b參數(shù)冀惭。
M 參數(shù)控制內(nèi)存， l默認(rèn)是1000掀鹅，低于這個(gè)長(zhǎng)度的序列丌用比對(duì)
S 默認(rèn)是100散休，輸出點(diǎn)也可以設(shè)置成500提高速度，也有1000
E 準(zhǔn)確性默認(rèn)是0.7一般的設(shè)置成0.75
B 參數(shù)決定一個(gè)job中包含的block之間比對(duì)的數(shù)目
T 參數(shù)是控制在一個(gè)block里一個(gè)kmer出現(xiàn)的最多次數(shù)乐尊，這個(gè)參數(shù)有的設(shè)置8戚丸，12，16.這個(gè)值
越小速度越快扔嵌。
k(kmer) 要小于32限府，線程數(shù)目T默認(rèn)是4.
- 保存配置文件后，直接執(zhí)行fc_run.py腳本即可
fc_run.py fc_run.cfg
- 結(jié)果文件較多痢缎，具體在官網(wǎng)查看胁勺，組裝的結(jié)果文件在下面
falcon_job/
├── 0-rawreads/ # Raw read error correction directory
組裝報(bào)告 └── report/ # pre-assembly stats
├── 1-preads_ovl/ # Corrected read overlap detection
├── 2-asm-falcon/ # String Graph Assembly
結(jié)果文件 └── a_ctg_all.fa # all associated contigs, including duplicates
結(jié)果文件 └── a_ctg.fa # De-duplicated associated fasta file
├── mypwatcher/ # Job scheduler logs
├── scripts/
└── sge_log/ # deprecated
寫(xiě)在最后
- 本文一共介紹了5款軟件，但以后肯定還會(huì)有更多更優(yōu)秀的軟件牺弄，但原理和用法都相差不大姻几，我們總歸是要選擇一個(gè)作為我們后續(xù)的分析宜狐，如何選？
- 組裝完成后蛇捌，就要對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行矯正抚恒，下一節(jié)介紹。
