Tumor cell-intrinsic epigenetic dysregulation shapes cancer-associated fibroblasts heterogeneity to metabolically support pancreatic cancer

Mitochondrial OXPHOS is activated in SETD2-deficient pancreatic tumors

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作者這兒首先對TCGA-PAAD 和 QCMG-PAAD 數(shù)據(jù)集進(jìn)行了基因集富集分析（QCMG：昆士蘭醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心）
無論TP53的突變情況搞莺，SETD2 突變伴KRAS 突變表現(xiàn)出OXPHOS（氧化磷酸化）的顯著富集
在針對STED2表達(dá)差異的GSEA分析中昧廷，也是OXPHOS富集

這兒找了兩種小鼠碎捺，KC鼠是LSL-KrasG12D和Pdx1-Cre兩種基因型魄藕，KSC鼠是LSL-KrasG12D和Pdx1-Cre加Setd2 f/f三種基因型梨树。
針對KC鼠和KSC鼠進(jìn)行單細(xì)胞埃碱，測出來六個(gè)簇盼产，分別是：
腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞踢关、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞库物、巨噬細(xì)胞霸旗、中性粒細(xì)胞以及 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞

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因?yàn)槭且认賹?dǎo)管癌，所以這兒先進(jìn)一步剖析腺泡/導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)微差異戚揭，作者將這簇細(xì)胞重新聚類為 5 個(gè)亞群（圖D诱告、E、F）
第一簇是：表達(dá) Amy2 和 Prss1 標(biāo)志物的腺泡細(xì)胞民晒，占主導(dǎo)地位精居，占細(xì)胞的一半以上
第二簇是：腺泡-導(dǎo)管化生 （ADM），共表達(dá)的腺泡和導(dǎo)管標(biāo)志物（Press1潜必、 Krt19 和 Epcam ）的亞簇
第三簇是：僅表達(dá)導(dǎo)管標(biāo)志物的簇靴姿，這兒進(jìn)一步劃分為三個(gè)亞簇，（都表達(dá)導(dǎo)管標(biāo)志物刮便，Sox9空猜、Krt19、Epcam恨旱，量不同）
擬時(shí)序分析顯示辈毯，整體演化軌跡也是從Acinar往Ductal的一個(gè)過程（圖G）
進(jìn)一步分析不同亞簇在KC和KSC的情況，其中Ductal 3主要來自于KSC（圖H）
進(jìn)一步看通路富集情況搜贤，炎癥反應(yīng)谆沃、脂質(zhì)代謝過程、OXPHOS和細(xì)胞分化在導(dǎo)管#3明顯富集（圖I）
同時(shí)看了一下相關(guān)因子的情況仪芒，干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（TF唁影，例如 Klf4 耕陷、 Klf5 和 Gata5 ）、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EMT） 相關(guān) 轉(zhuǎn)錄因子 Twist1 和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子 Pparg 富集在導(dǎo)管 #3 中富集（圖J）
進(jìn)一步進(jìn)行GSEA分析證實(shí)了KSC中導(dǎo)管惡性細(xì)胞的OXPHOS和脂肪酸代謝的富集（圖K）
表現(xiàn)出來就是KSC的耗氧率（OCR）增加（圖L）

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已經(jīng)確定了Stet2和OXPHOS富集相關(guān)据沈，這兒進(jìn)一步去看在模型中的情況哟沫。
在細(xì)胞中，作者應(yīng)用OXPHOS抑制劑Gboxin锌介，結(jié)果顯示KSC腫瘤尺寸縮小更明顯嗜诀。（圖A）
進(jìn)一步看了一下膜電位情況和干性相關(guān)TF的情況，結(jié)果顯示KSC的膜電位更高孔祸，干性更強(qiáng)隆敢，在Gboxin處理后降低更明顯。（圖B崔慧、C）
這兒想進(jìn)一步驗(yàn)證KSC的一個(gè)情況拂蝎，所以這兒就用了KSC小鼠模型
在KSC小鼠模型中，應(yīng)用了體內(nèi)藥物制劑s-Gboxin惶室，結(jié)果基本一致温自。小鼠腫瘤大小縮小，肝轉(zhuǎn)移減少皇钞，生存邊長（圖D-G）
同時(shí)捣作，OCR情況說明s-Gboxin對小鼠荷瘤的OXPHOS具有顯著抑制。（圖H）
進(jìn)一步看Sted2敲除的腫瘤鹅士，結(jié)果顯示，對于藥物顯著抑制這類腫瘤的生長惩坑，延長了生存期掉盅，抑制了OXPHOS。（圖I-K）

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那么進(jìn)一步深入探索代謝的細(xì)節(jié)以舒，葡萄糖趾痘、谷氨酰胺和脂肪酸都是線粒體的呼吸底物，所以這兒就想看看OXPHOS升高和哪一個(gè)底物相關(guān)蔓钟。
這兒用了三種藥物去處理 分選出來的Setd2WT 和 Setd2KO 細(xì)胞永票，分別是UK-5099（線粒體丙酮酸載體，MPC抑制劑）滥沫，BPTES（谷氨酰胺酶抑制劑）侣集，Etomoxir（肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A，CPT1α抑制劑）
結(jié)果顯示兰绣，Setd2KO PDAC 細(xì)胞的基礎(chǔ) OCR 呼吸被 Etomoxir 顯著抑制（圖A）
在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中 世分，所有抑制劑都減少了 Setd2 ko 腫瘤生長，其中 Etomoxir 作用最顯著缀辩。（圖B）
這說明作者推測這類細(xì)胞主要是通過脂肪酸 β-氧化 (FAO) 來維持 OXPHOS
既往認(rèn)知中臭埋，正常胰腺和胰腺腫瘤都不富含脂質(zhì)踪央，但作者發(fā)現(xiàn)原位 Setd2 KO腫瘤中存在大量脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞（圖C）
多重免疫熒光提示 脂滴 (LD) 上的周脂蛋白 1 (PLIN1) 和周脂蛋白 2 (PLIN2) 水平升高，同時(shí)瓢阴，這些 LD 陽性細(xì)胞主要與泛 CAF 標(biāo)記足平蛋白 (PDPN) 共染色畅蹂，但較少與 CK19（胰腺腫瘤細(xì)胞標(biāo)記）共染色（圖D）
所以作者認(rèn)為，表明這些 LD 陽性細(xì)胞主要是 CAF荣恐，
與 Setd2 WT 腫瘤相比液斜，來自Setd2ko 腫瘤中的PDPN + 細(xì)胞包含中性脂質(zhì)（以 BODIPY 表示）（圖E）且細(xì)胞內(nèi)甘油三酯 (TG)、非酯化脂肪酸 (NEFA) 和膽固醇升高（圖F）
因此這兒募胃，作者得出結(jié)果：Setd2 的缺失會(huì)誘導(dǎo)富含脂質(zhì)的基質(zhì)的形成旗唁，可能作為腫瘤細(xì)胞中維持 FAO-OXPHOS 的能量來源。

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進(jìn)一步的痹束，作者探索了富含脂質(zhì)的基質(zhì)增加的起源检疫，這兒進(jìn)一步對之前單細(xì)胞的CAF部分進(jìn)行分析，分為4簇（圖A）
其中C3在KC腫瘤中普遍存在祷嘶，而C2在KSC腫瘤中占主導(dǎo)地位（圖B）
擬時(shí)序分析鑒定了 C3 和 C2 的不同進(jìn)化軌跡（圖C）
進(jìn)一步分析（圖D）
C1 亞群顯示出類似于 inflammatory fibroblast (iCAF) 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
C2中富集最多的標(biāo)記基因是 Abca8a 屎媳、 Cxcl14 和 Lpl
C3 CAFs表現(xiàn)出myofibroblast (myCAF)特征，Mfap4 论巍、 Col1a1 和 Col1a2
進(jìn)一步進(jìn)行GSEA烛谊， C3主要是富集到氧化磷酸化、缺氧和膠原纖維組織途徑嘉汰，進(jìn)一步證實(shí)了它們與 myCAF 的相似性
C2特征基因顯示出與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脂肪生成相關(guān)的不同轉(zhuǎn)錄組丹禀，表明脂質(zhì)代謝特征（圖E）。

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接著就看不同腫瘤里的CAF情況鞋怀，多重免疫熒光提示双泪，Acta2 （編碼α-SMA）表達(dá)特異性存在于C3 CAF中，而 Fap 和 Abca8a 主要存在于C2 CAF中（圖F）
進(jìn)一步看KSC密似、KC和KPC中的表達(dá)情況
α-SMA + CAF 在 KSC 腫瘤中表達(dá)較少焙矛，F(xiàn)ap+ CAF 在KSC 腫瘤中顯著增加，且位于導(dǎo)管腫瘤細(xì)胞附近残腌，而在 KC村斟、KPC 和 KSC 腫瘤中，PDPN+ FAP? α-SMA- CAFs（除了上述兩種的其他CAF） 位于腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端（圖G-H）
總的來說抛猫，具有脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)錄組特征的C2 CAF主要位于KSC腫瘤中蟆盹，其獨(dú)特的空間分布表明它們可能與腫瘤細(xì)胞有密切的相互作用。

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因?yàn)镃2富集到脂質(zhì)相關(guān)通路邑滨，且KSC中富集日缨，作者進(jìn)一步的驗(yàn)證了是不是C2 CAF導(dǎo)致了 KSC中的脂質(zhì)堆積。
這兒用PDPN+ ABCA8a+ FAP+ 來篩選C2 CAF掖看，并且用PDPN+ ABCA8a? FAP-作為對照
結(jié)果顯示匣距，KSC中的C2 CAF明顯更多面哥，且含有更多的中性脂質(zhì)，以及更豐富的細(xì)胞內(nèi) TG （甘油三酯）和 NEFA（血清游離脂肪酸）（圖I-K）
總結(jié)一下這兒就是論證了Setd2缺陷的腫瘤具有富含脂質(zhì)表型的C2 CAF

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現(xiàn)在就要進(jìn)一步去看CAF和合富含脂質(zhì)環(huán)境的關(guān)系
CAF 的異質(zhì)性是由來自遺傳多樣性腫瘤細(xì)胞和 TME 的多種線索決定的毅待，其中來自腫瘤細(xì)胞的信號被認(rèn)為是主要影響的因素尚卫，所以這兒就往信號通路去看了。先前的一項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞固有的 TGFβ 和 IL-1/JAK/STAT3 信號傳導(dǎo)分別是 myCAF 和 iCAF 形成的主要途徑尸红。
所以這兒就想看一下CAF細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞間的通訊情況吱涉，結(jié)果顯示BMP 信號傳導(dǎo)是關(guān)鍵因素（圖A）。
BMP2 表達(dá)在Ductal 3中占主導(dǎo)地位外里，并與 C2 CAF 中的受體表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相互作用怎爵，另外，C2 CAF 表現(xiàn)出升高的 BMP4 水平盅蝗，并表現(xiàn)出顯著的 BMP4 配體-受體相互作用鳖链。（圖右上角）
綜上，結(jié)果懷疑表明Setd2 缺陷的胰腺腫瘤旁分泌 BMP2 信號從導(dǎo)管細(xì)胞到 CAF墩莫，還會(huì)自分泌 BMP4 信號傳導(dǎo)
那么既往研究報(bào)道了芙委， BMP2 和 BMP4 可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞反式分化為脂質(zhì)儲(chǔ)存細(xì)胞
在 Setd2ko的條件培養(yǎng)基 （CM） 中培養(yǎng)主要 CAF 祖細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞 （PSC） 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （BMSC） 狂秦，結(jié)果顯示顯示脂質(zhì)載量表型和脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)（圖DE）灌侣。
用中和抗體阻斷BMP2可有效防止暴露于Setd2ko的CM中的PSC的脂質(zhì)積累 （ 圖FG）。

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為了進(jìn)一步研究 BMP2/BMPR 軸在富含脂質(zhì)的 ABCA8a+FAP+ CAFs 形成中的作用
這兒在小鼠體內(nèi)沉默 了Bmp2
Setd2KO-shBmp2 PDAC細(xì)胞的CM中的PSCs的脂質(zhì)儲(chǔ)存顯著降低（圖I）
同時(shí)裂问，Bmp2 沉默顯著減少了Setd2KO腫瘤的進(jìn)展侧啼，伴有ABCA8a+FAP+ CAF減少（圖IJ）
總的來說，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了BMP2/BMPR1a軸在促進(jìn)CAFs富脂表型和影響 Setd2KO PDAC的整體增殖

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最近的研究揭示了 CAF 在提供氨基酸堪簿、核苷和外泌體以滋養(yǎng)腫瘤細(xì)胞方面的作用慨菱。
在空間上，我們觀察到KSC中富含脂質(zhì)的CAF與惡性細(xì)胞之間的密切相互作用（前文圖GH）
因此就想看看戴甩，富含脂質(zhì)的CAF是否將脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞中以支持其OXPHOS和生長
通過離體脂質(zhì)脈沖追蹤測定（圖A），作者發(fā)現(xiàn)Setd2缺失腫瘤中分離的 CAF 能夠更有效地將更多的熒光長鏈脂肪酸（LCFA闪彼、BODIPY-C16）轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞中（圖BC）

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這兒作者為了進(jìn)一步探索脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的機(jī)制甜孤，去集中研究了前面C2 CAF的Marker分子ABCA8a（正好這個(gè)是脂代謝相關(guān)的marker）
結(jié)果顯示， ABCA8a 的過表達(dá)促進(jìn)了 BODIPY-C16 從 iPSC 的外流及其轉(zhuǎn)運(yùn)到 PDAC 細(xì)胞中畏腕，相反缴川， Abca8a 的耗竭減少了BODIPY-C16外排及其向PDAC細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖DE）。
先前的研究表明描馅，富含脂質(zhì)的細(xì)胞通過游離脂肪酸或細(xì)胞外囊泡將其脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到周圍細(xì)胞把夸。所以作者想看是轉(zhuǎn)移的什么類型的脂質(zhì)。
首先铭污，作者將 BODIPY-C16 標(biāo)記的 iPSC 的 CM 根據(jù)大小分為三部分：
游離脂肪酸 （<10 kDa）
脂肪酸載體：中型 （10-100 kDa） 和大型 （>100 kDa） 級分恋日。
在大尺寸（>100 kDa）和中型（10-100 kDa）脂肪酸組分處理的PDAC細(xì)胞中觀察到熒光信號增加（圖FG）
另一方面膀篮，iPSC中ABCA8a的過表達(dá)增加了BODIPY-C16向PDAC細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是在中等大小的CM組分中岂膳，類似于ABC家族介導(dǎo)的高密度脂蛋白（HDL）顆粒的大惺母汀（圖FG）
進(jìn)一步的，作者研究 CAF 中 ABCA8a 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對 體內(nèi) 腫瘤生長的影響
iPSC 與 PDAC 細(xì)胞的共同接種顯著促進(jìn)了 Setd2 WT 和 Setd2 ko組的tumor谈截。（圖H）
Setd2 ko 組中
iPSCs中 Abca8a 的耗竭減少促腫瘤生長的作用
而iPSC 的 Abca8a 過表達(dá)加速了 Setd2 ko 腫瘤生長
驗(yàn)證了我們的假設(shè)筷屡， 將 Setd2 缺陷的 PDAC 細(xì)胞植入 Abca8a ?/? 小鼠，腫瘤的生長速度比野生型小鼠慢（圖I-K）簸喂。

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進(jìn)一步的就開始討論到表觀
既往研究強(qiáng)調(diào)了 H3K36me3 在與其他組蛋白標(biāo)記共存中的關(guān)鍵作用毙死，例如基因內(nèi) H3K27me3 或組蛋白 H4 乙酰化喻鳄。
在Setd2 ko 的原位腫瘤中 H3K27me3 和 H3K27Ac 水平顯著增加扼倘，同時(shí) H3K36me3 水平降低 （圖A），在KSC小鼠的胰腺腫瘤中也觀察到一樣的結(jié)果（圖B）诽表。
Setd2 ko 腫瘤表現(xiàn)出乙酰輔酶A水平的特異性增加唉锌，乙酰輔酶A水平是線粒體代謝的關(guān)鍵代謝物（圖C）。
用CPT1a抑制劑或ACLY抑制劑（ETC-1002）阻斷FAO可能在很大程度上損害腫瘤中的乙酰輔酶A和H3K27Ac（圖D）竿奏，強(qiáng)烈表明FAO-OXPHOS代謝過程增強(qiáng)與H3K27Ac的表觀遺傳重寫之間存在關(guān)聯(lián)袄简。

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進(jìn)一步，作者對從Setd2 WT 和 Setd2 ko 原位腫瘤中分選的PDAC細(xì)胞中的 H3K27Ac 和 H3K27me3 進(jìn)行了 CUT&Tag 分析
并將RNA-seq數(shù)據(jù)與H3K27Ac和H3K27me3峰相關(guān)基因集的取交集泛啸，在基因體上具有H3K27Ac增益的基因顯示出顯著的整體上調(diào)绿语，而與H3K27me3的關(guān)聯(lián)較少（圖DE）
研究表明，以組蛋白乙鹾蛑罚化為標(biāo)志的基因內(nèi)增強(qiáng)子與基因外增強(qiáng)子和啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)結(jié)合吕粹。
重點(diǎn)關(guān)注基因體和啟動(dòng)子區(qū)域 H3K27Ac 增加的 339 個(gè)重疊基因，它們與 ECM 受體相互作用岗仑、谷胱甘肽代謝匹耕、黏著斑、TGF-β 信號傳導(dǎo)荠雕、細(xì)胞遷移和 OXPHOS 相關(guān)（圖F）稳其。
值得注意的基因包括 Bmp2 、小窩內(nèi)吞調(diào)節(jié)因子（ Cav2 炸卑、 Cavin2 和 Cavin3 ）既鞠、谷胱甘肽代謝基因（ Idh1 、 Gpx2 盖文、 Gsto1 嘱蛋、 Gsto2 、 Mgst3 和 Nqo2 ）、FAO-OXPHOS 相關(guān)基因（ Acadl 和 Acsl5 ）和與干性相關(guān)的TF（ 圖F-H）洒敏。

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因?yàn)橹笆荋3K27Ac和H3K36me3
這兒就想看DEG 上的 H3K27Ac 增益是否直接取決于 H3K36me3 信號的丟失龄恋。
只有大約 10% 的 DEG（339 個(gè)中的 33 個(gè)，例如 Bmp2 桐玻、 Idh1 和 Klf4 的基因體中具有 H3K36me3 沉積 ）
在 Setd2 WT PDAC細(xì)胞篙挽，表明SETD2介導(dǎo)的H3K36me3缺失全局獨(dú)立改變H3K27Ac（圖H）。
IGV顯示 Setd2 缺失后啟動(dòng)子（綠色）和基因體（粉紅色镊靴、前兩個(gè)內(nèi)含子和/或外顯子區(qū)域）中的 H3K27Ac 峰增加
Setd2 铣卡，與 AP-1 家族 TF、JunB 和 Fosl1 結(jié)合一致（圖H）
我們進(jìn)一步研究了 H3K27Ac 增益對 Setd2 ko PDAC的進(jìn)展偏竟。在原位腫瘤中煮落，JQ1 部分抑制 Setd2 ko 腫瘤細(xì)胞中腫瘤生長、富含脂質(zhì)的 TME 和 OXPHOS 活性（圖I-K）踊谋。JQ1 還抑制了 Setd2ko中異位 H3K27Ac 沉積上調(diào)的基因表達(dá) （圖L）蝉仇。
綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明 Setd2 缺失誘導(dǎo)異位 H3K27Ac 沉積殖蚕，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組重編程轿衔，從而改變腫瘤進(jìn)展的代謝適應(yīng)。

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最后作者也扯了臨床相關(guān)性
這兒研究了SETD2/H3K36me3 水平與 ABCA8+FAP+的 人PDAC（hPDAC）中的CAFs 睦疫。
與動(dòng)物模型一致害驹，H3K36me3與ABCA8+FAP+hPDAC中的CAF呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證（圖A-C）蛤育。
同時(shí)宛官，H3K36me3 低 hPDAC 組織中存在脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞和分化程度較低的腫瘤細(xì)胞（圖D）
此外，IHC 染色顯示 H3K36me3 和 FAP 水平呈負(fù)相關(guān) （ χ 2 = 20.930瓦糕， p < 0.001）底洗，而 H3K36me3 與 PDPN 水平呈正相關(guān) （ χ 2 = 9.871， p = 0.002） （ 圖E）
總的來說咕娄，與KC小鼠相比亥揖，KSC小鼠胰腺組織 存在ABCA8+ FAP的 + CAF ，而總 CAF （PDPN + 細(xì)胞）較低圣勒。

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當(dāng)然徐块，如 圖 1 所示，具有 SETD2 突變或低 mRNA 水平的 PDAC 表現(xiàn)出更高的 OXPHOS 活性灾而。
最后作者用了PDX模型，將 S-Gboxin 和 JQ1 施用到 H3K36me3 low （n = 2） 和 H3K36me3 high（n = 3）胰腺PDX中（圖F）扳剿。H3K36me3水平較低的PDAC對S-Gboxin和JQ1表現(xiàn)出更高的敏感性（圖F）旁趟。相反，H3K36me3水平較高的PDAC對S-Gboxin表現(xiàn)出適度的反應(yīng)，對JQ1沒有顯著的反應(yīng)锡搜。 驗(yàn)證了臨床效果橙困。