蛋白質組知識背景

蛋白質組(proteome)：由一個細胞娜饵、一個組織或一個機體的基因組所表達的全部相應的蛋白質坡贺，是一個整體的概念。

蛋白質組學(proteomics)：以蛋白質組為研究對象，從蛋白質整體水平來認識重合活動規(guī)律的科學遍坟，是后基因組計劃的重要組成部分拳亿。

蛋白質組學本質上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平愿伴、翻譯后的修飾肺魁、蛋白質與蛋白質相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病機理隔节、細胞代謝等過程的整體而全面的認識鹅经。

蛋白質組學分類

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常用的是非標Label Free，以及標記的iTRAQ分板技術怎诫。

定量蛋白組學

定量蛋白組學：研究不同條件下蛋白表達水平的變化（上下調情況）瘾晃。

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iTRAQ知識背景

iTRAQ的全稱是Isobaric tag for relative and absolute quantitation，翻譯為中文就是同重元素標記的相對與絕對定量技術幻妓。這是由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同重同位素標記的相對與絕對定量技術蹦误。該技術利用同位素試劑可同時標記8個多肽樣品，標記的多肽樣品等量混勻后肉津，經液相色譜分離及串聯質譜（MS/MS）分析强胰，可得到各肽段的一、二級質譜信息妹沙。

在一級質譜中哪廓，不同樣品來源的同一肽段表現出相同的質荷比；

在二級質譜中初烘，化學鍵斷裂釋放出iTRAQ報告離子涡真，在質譜低質量區(qū)產生了8個報告離子峰，其強度反應了該肽段在不同樣品中的相對表達量信息肾筐，另外二級質譜中的肽段碎片離子峰質荷比反應了該肽段的序列信息哆料；這些質譜原始數據經過數據庫檢索，可得到蛋白質的定性和相對定量信息吗铐。

iTRAQ技術在微生物抗協(xié)迫機制和動植物發(fā)育分化機理研究及醫(yī)學生物標記物篩選領域都有廣泛應用东亦。

iTRAQ：采用4種或8種同位素標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團唬渗，進行串聯質譜分析從而比較不同樣本中蛋白質的相對含量典阵，其特點是：

• 蛋白通量高，覆蓋度高镊逝；

• 定量準確壮啊，可信度高；

• 分離能力強撑蒜、分析范圍廣歹啼，定性結果可靠玄渗；

• 自動化程度高、分析時間快狸眼，分離效果好藤树。

定量蛋白質組原理

iTRAQ試劑

• iTRAQ試劑是可與氨基酸末端及賴氨酸側鏈連接的胺標記的同位素元素；
• iTRAQ試劑由三部分組成：報告基團拓萌、質量平衡基團和肽反應標記試劑基團岁钓；
• 報告基因：常見4標或8標，可同時標記4組或8組樣品微王，報告基團有8種分子量施蜜，范圍從113到121（無120）份蝴；
• 平衡基因：保證iTRAQ標記的同一肽段的質荷比相同已卸，平衡基團也8有種不同的分子量翠订，與不同的報告基團搭配，能保證被標記的不同來源的同一肽段在一級質譜中具有相同的質荷比激才，就是下圖中右側的部分拓型，在上圖，也就是a圖中瘸恼，它們的荷質比都是145.10劣挫，在下圖，也就是b圖中东帅，荷質比都是305.10压固；
• 肽反應標記基團：可與肽段N端及辣氨酸側鏈發(fā)生共價連接，從而標記上肽段靠闭。

這幾個試劑的結構如下所示：

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（圖片來源于：Aggarwal S., Yadav A.K. (2016) Dissecting the iTRAQ Data Analysis. In: Jung K. (eds) Statistical Analysis in Proteomics. Methods in Molecular Biology, vol 1362. Humana Press, New York, NY,277）

iTRAQ的實驗流程原理

在質譜峰圖中帐我，雖然不同樣本帶有不同的同位素標簽，但是經過質量平衡基因的平衡愧膀，任何一種試劑標記不同樣本中的同一蛋白多肽表現為相同的質荷比拦键，從而形成單一的峰。

在串聯質譜結果中檩淋，經過激光通量轟擊肽段芬为，iTRAQ試劑的三部分之間的鍵斷裂，平衡基因斷裂蟀悦，平衡基團丟失媚朦，不同同位素標簽的同一多肽的離子信號表現為不同質荷比的峰，因此可根據波峰的高度和面積比較同一蛋白不同處理的定量信息日戈，如下所示：

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（圖片出處為：Aggarwal S., Yadav A.K. (2016) Dissecting the iTRAQ Data Analysis. In: Jung K. (eds) Statistical Analysis in Proteomics. Methods in Molecular Biology, vol 1362. Humana Press, New York, NY询张，P278）

一級質譜：

二級質譜：

常規(guī)實驗流程

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實驗流程如下所示：

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第一步：蛋白酶解樣本，也就是將蛋白樣本酶解為肽段涎拉；

第二步：使用iTRAQ同位素標記瑞侮，也就是使用不同的iTRAQ標簽來標記不同的肽段樣本；

第三步：SCX預分級鼓拧，使用強陽離子交換SCX（HPLC）將肽段分為多個組分半火；

第四步：使用LC-MS對每個組分進行質譜檢測。

質譜儀的組成部分

蛋白質譜的核心就質譜季俩，原理就是樣本在特定條件下轉變?yōu)楦咚龠\動的離子钮糖，根據離子質荷比的不同在靜電場和磁場作用下進行分離，再用特定檢測器記錄不同質荷比的各離子的相對強度并形成質譜圖酌住。

質譜儀

質譜儀：在真空狀態(tài)下分析離子的質荷比m/z店归，質譜儀主要是由離子源、質量分析器和離子檢測器組成酪我，iTRAQ技術中常用LC-MS/MS消痛，液相色譜串聯質譜。

• 離子源：將蛋白或多肽變成氣態(tài)的帶電離子都哭，常用的有2類：①電噴霧電泳ESI秩伞；②基質輔助激光解吸電離MALDI（脈沖方式使用樣本離子化0；

• 質量分析器：將離子源形成的離子按質荷比大小分開：常見有的5類：①四級桿(Quadrupole)欺矫；②離子阱(Ion trap)纱新；③飛行時間(TOF)；④傅里葉(FTICR)穆趴；⑤軌道阱(Qrbitrap)脸爱。

質量分析器的參數

質量分析器的質量范圍是指測定質荷比范圍，它決定了能檢測到的離子范圍未妹，例如ESI離子源可產生許多質荷比大于3000的離子簿废，但是如果質量分析器的上限達不到3000，則就無法檢測大于3000的離子络它。

分辨率：觀測到的質譜峰的質荷比/半峰高處的峰寬(FWHM)捏鱼。

不同類型質量分析器的比較

不同質量分析器有不同的分辨率，其中傅里葉>軌道阱>時間飛行>離子阱>四級桿酪耕，具體的參數如下所示：

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市場上不同型號質譜儀的比較：

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其中在使用iTRAQ分析時导梆，比較常用的是Thermo的Q-Exactive與Q-Exactive HF。

• 離子檢測器：①直接檢測器迂烁；②電子倍增器看尼；③閃爍檢測器。

• 液相色譜LC：利用物質在流動相和固定相中的分配系數差異盟步，進行分離檢測藏斩。

• 質譜MS：把不同質荷比的離子分開排列成譜。

實驗方案設計

教學視頻中的案例是植物方向却盘，其實原理跟動物方向一樣的狰域，以下的都是植物蛋白質譜的實驗設計媳拴。

方案設計-生物學重復

1. 至少設置3個以上的生物學重復；
2. 為了增加實驗結果的可靠性兆览，可通過增加質譜的技術重復上機次數屈溉；
3. 嚴謹的實驗通常進行3次生物學重復和3次技術重復，也就是一共9批MS數據抬探；
4. 出于經費考慮子巾，有的文獻也只進行2-3次技術重復（在動物實驗方面，技術重復就是同一個樣本上3針質譜即可）小压。

方案設計-不同組樣本的標記選擇和上機組合

兩組樣品

常見的組合包括2組线梗，3組，4組怠益，5組仪搔，6組樣本，現在以植物干旱無罪推定研究為例說明一下蜻牢。

假設我們有2組樣本僻造，對照組這里用CK表示，它表示正常澆水孩饼；實驗組使用Treatment不勝感激髓削，它表示不澆水3天，現在有2個方案：

第一個方案：每組2個生物學重復镀娶，1個3標立膛；

第二個方案：第組3個生物學重復，1個6標梯码，如下所示：

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三組樣本

現在將實驗擴展一下宝泵，我們使用3組：

對照組：CK，正常澆水轩娶；

干預組不澆水儿奶，包括2組：

不澆水3天：T1

不澆水6天：T2

第一個方案：每組兩個生物學重復，1個6標鳄抒；

第二個方案：每組3個生物學重復闯捎，3個4標或1個9標，如下所示：

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四組樣本

對照組：CK许溅，正常澆水

處理組：Treatment

不澆水3天：T1

不澆水6天：T2

不澆水9天：T3

方案一：每組2個生物學重復瓤鼻，1個8標；

方案二：每組3個生物學重復贤重，3個4組茬祷，如下所示：

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五組樣本

對照組：CK，正常澆水

處理組：Treatment

不澆水1天：T1

不澆水2天：T2

不澆水3天：T3

不澆水4天：T4

方案一：每組3個生物學重復并蝗，3個5標祭犯；

方案二：每組3個生物學重復秸妥，3個6標，如下所示：

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實驗方案小結

• 需要比較的差異分組放在同一組標記中沃粗；
• 不同組織部位不要放在一組標記中檢測粥惧；
• 生物學重復可分批上機，此時可不需要內參陪每；
• 可將所有樣本混合作為內參影晓，分析時可通過內參間接找到有無變化的蛋白質镰吵。

蛋白數據分析流程

iTRAQ定量蛋白組數據分析流程如下所示：

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從質譜儀上拿到的數據是原始質譜數據檩禾，然后要將原始數據進行一個數據格式轉換，數據轉換后疤祭，要進行搜庫來鑒定蛋白質盼产，這一步是要看找到了多少個蛋白質，隨后對找到的蛋白進行蛋白定量勺馆。

定量后就是各種分析戏售，包括GO，KEGG草穆，蛋白相互作用等灌灾。

[一]搜庫

搜庫是指通過實驗得到的譜圖與數據庫中的理論譜圖進行匹配，得到可能的肽段序列悲柱，從而鑒定蛋白質锋喜，進行搜庫的操作就是將質譜儀得到的譜圖輸入到搜庫軟件，常用的搜庫軟件包括：

• ProteinPilot(AB SCIEX)
• Proteome Discoverer(Thermo scientific)
• Mascot（這個軟件是上述2個軟件的核心）

數據的產生其實就是：蛋白->肽段->譜圖豌鸡；而數據分析就是這個過程的逆過程嘿般，即譜圖->肽段->蛋白。

整個流程如下所示：

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搜庫的原理

搜庫軟件運行的主要步驟包括：

1. 從數據庫中選擇分子量與輸入值相等的肽段涯冠；
2. 形成理論碎片炉奴，并進一步生成理論譜圖；
3. 將實驗譜圖與理論譜圖進行匹配蛇更；
4. 對匹配進行打分瞻赶；
5. 按打分進行排序，通過統(tǒng)計學分析派任，確定最佳的匹配結果并導出共耍。

流程示意圖如下所示：

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搜庫數據庫的選擇

數據庫的選擇是基于質譜數據的蛋白質鑒定策略中的重要一步，最終鑒定到的蛋白序列都來源于被選擇的數據庫吨瞎。

• 如果是已經測序的生物痹兜，直接選用該物種蛋白數據庫(NCBI)，或同批樣本轉錄組數據構建的蛋白庫颤诀。
• 如果是非測序生物字旭，則選擇與被測樣本最為相關的大類蛋白質組數據庫对湃；
• NCBInr分類庫，包括動物全庫遗淳、植物全庫拍柒、微生物全庫、細菌全部庫等屈暗。
• SwissProt/UniProt分類庫拆讯，動物全庫、植物全庫养叛、微生物全庫种呐、細菌庫等。

蛋白質譜鑒定的結果

定量蛋白質鑒定數目一般在幾千左右弃甥，遠少于轉錄組檢測的表達的基因數目和參考基因組的基因數目爽室，如下所示：

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右上圖是根據分析量來確定的蛋白數據，右下圖是根據肽段來確定的鑒定的蛋白數目淆攻。蛋白鑒定的數目跟轉錄鑒定的基因不在一個數量級上阔墩，這是因為蛋白質譜在實驗的通量，數據庫瓶珊，實驗技術方面都有一定的局限啸箫。

[二]蛋白質功能注釋

通過搜庫對蛋白質進行鑒定后，接著就是對這些搜到的蛋白進行功能注釋伞芹，這有助于了解蛋白的功能忘苛，從而解析樣本相關表型，常用于功能注釋的數據庫有：GO丑瞧、COG柑土、KEGG、NR绊汹、Pfam稽屏、Swiss-Prot，下圖是一個玉米的項目西乖，玉米的蛋白在各個數據庫中的注釋結果：

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數據庫介紹

NR

全稱是Non-redundant protein sequences狐榔，包含GenBank所有編碼序列，以及PDB获雕，swissprot薄腻，PIR，PRF數據庫的所有編碼序列的一個非冗余數據庫届案，其數據庫完整度高庵楷；這是一個氨基酸序列數據庫。

Pfam

全稱是Protein families database，通過蛋白序列的比對建立了每個家族的氨基酸序列的HMM統(tǒng)計模型尽纽，是最全面的蛋白結構域注釋的分類系統(tǒng)咐蚯；通過識別蛋白質的結構域序列，可以預測蛋白質的功能弄贿。

Swiss-Prot

這是上EBI維護的數據庫春锋，主要收錄人工注釋的序列及其相關文獻信息和經過計算機輔助分析的序列；注釋結果包括對蛋白質功能差凹、酶學特性期奔、剪接異構體、相關疾病信息的注釋等待危尿，注釋結果無冗余呐萌。

COG

全稱是Clusters of Orthologous Groups of proteins，這是一個蛋白質直系同源數據庫脚线。通過對菌類搁胆，藻類和真核生物等66個完整基因組的編碼蛋白弥搞，根據系統(tǒng)進化關系構建而成邮绿。這對于預測單個蛋白的功能和整個基因組中蛋白質的功能具有重要的作用。

GO與KEGG

常見攀例，不介紹船逮。

[三]定量

蛋白定量原理回顧

先來了解一下iTRAQ蛋白質定量的原理，如下所示：

• iTRAQ試劑是等量的粤铭，因此不同同位素在標記同一多肽后在一級質譜檢測中挖胃，分子量完全相同。
• 在一級質譜檢測到前體離子后進行碰撞誘導解離梆惯，產物離子通過二級質譜進行分析酱鸭。
• 在二級質譜中，報告基團垛吗、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂凹髓，質量平衡基團丟失，產生低質荷比(m/z)的報告離子怯屉。
• 由于二級質譜可分析相對分子質量相差為1的報告基團蔚舀，不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽相對豐度。
• 多肽內的酰胺鍵斷裂锨络，形成一系列b離子和y離子赌躺，得到離子片段的質量數，通過搜庫就可以鑒別出相應蛋白質羡儿。

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蛋白定量分析工具

• 常用的軟件前面已經提了礼患，包括：IQuant(BGI), ProteinPilot(AB SCIEX)、Proteome Discoverer(Thermo scientific)
• IQuant：整合了Mascot算法，采用機器學習算法自動對搜索結果進行重新打分缅叠，提高結果的鑒定率咏瑟。

核心的值有3個：

1. 在譜圖/肽段水平進行1%FDR的過濾(PSM-level PDF<=0.01)，獲得顯性性鑒定的譜圖和肽段列表痪署。
2. 基于簡約原則(the parsimony principle)码泞， 利用肽段進行蛋白組裝，并生產一系列的蛋白組狼犯。
3. 在蛋白質水平以FDR 1%再次進行過濾(Protein-level FDR<=0.01)余寥，以控制蛋白的假陽性。

IQuant的工作流程為：

蛋白質過濾 --> 報告基團標簽純度校正 --> 定量值歸一化 --> 缺失值補全 --> 蛋白定量值計算 --> 統(tǒng)計檢驗悯森。

[四]差異蛋白篩選

對蛋白進行定量后宋舷，需要對蛋白的差異進行篩選，篩選的內容包括3個瓢姻，如下所示：

• 根據實驗設計來設置差異分析祝蝠，例如A_VS_B；
• 顯示差異蛋白選擇的閾值幻碱，Fold Change > 1.2或1.5和Q-value < 0.05绎狭；
• 統(tǒng)計學方法：t-test或ANOVA。

現在來看一個差異計算后的結果：

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第1列是蛋白名稱褥傍；

第2列到第4列是3個生物學重復儡嘶；

第5列與第6列是FC與pvalue。

[五]富集分析

富集分析常見的就是GO分析與KEGG分析恍风，不介紹蹦狂。

[六]表達聚類和蛋白互作

表達聚類分析的核心就是熱圖與聚類圖，不介紹朋贬。

蛋白相互作用通常使用的數據庫是STRING數據庫凯楔，它能分析預測差異蛋白質之間的互作關系，這個數據庫的主要信息如下

• STRING是一個搜索已知蛋白之間和預測蛋白之間相互作用系統(tǒng)的數據庫锦募，包括蛋白質直接物理的相互作用摆屯，也包括蛋白質之間間接功能相關性；
• 數據包括：實驗數據御滩、從PubMed摘要中挖掘結果鸥拧，利用生物信息學方法預測的結果；
• 通過打分對不同方法得來的結果給予一定權重削解，得到綜合打分富弦，且可根據打分結果繪制蛋白相互作用網絡圖，它的網絡圖如下所示：

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案例解析

先來看一篇文獻氛驮，文獻內容如下所示：

Liancheng Wu, Shunxi Wang, Lei Tian, Liuji Wu, Mingna Li, Jun Zhang, Pei Li, Weiqiang Zhang, Yanhui Chen
Comparative proteomic analysis of the maize responses to early leaf senescence induced by preventing pollination,Journal of Proteomics,Volume 177,2018,Pages 75-87,ISSN 1874-3919.

研究背景

玉米是一種一年生作物腕柜，葉片衰老的過早或過晚都可能會影響產量，在成熟后期，營養(yǎng)物質的再活化受到負面影響盏缤，導致幼葉的光合作用受損和系列能力下降砰蠢，相反，過早的葉片衰老則阻礙了植物生長并降低其CO2的同化能力唉铜。葉片衰老是一個高度調控的過程台舱，由幾個稱為衰老相關基因(SAGs)的基因介導，然后在蛋白質水平上僅鑒定了少數SAG潭流。目前竞惋，使用蛋白質組學分析全體蛋白質波動比功能分析的轉錄組學更有效，因為蛋白質與功能更直接相關灰嫉。本研究的目的是拆宛，研究玉米阻斷授粉誘導葉片衰老過程中蛋白質的全局差異積累和代謝物質的變化。

葉片衰老的生理特征

葉片衰老通常與植物衰老以及開花和種子形成有關讼撒。葉色也與葉片衰老有關浑厚，是植物重合周期階段的可見指標。葉片衰老時會出現一系列的生理過程根盒，包括葉綠素分解钳幅、光合作用停止、蛋白質和核酸降解郑象、分解代謝和營養(yǎng)物質的運輸贡这，以及細胞死亡反應茬末，從而導致營養(yǎng)物質再循環(huán)到新發(fā)育的營養(yǎng)器官和生殖器官厂榛。

分子機制研究進展

葉片衰老可以通過許多環(huán)境和內源信號來調節(jié)，包括年齡丽惭、發(fā)育信號和植物生長調節(jié)劑击奶。植物激素與植物中的各種生物過程（包括葉片衰老）相關，如外源施用脫落酸(ABA)可促進葉片衰老责掏，內源ABA水平在幾種植物葉片衰老后增加柜砾。

水楊酸(SA)是另一種對葉片衰老正調控的植物激素，而生長素换衬、細胞分裂素和赤霉素對葉片衰老有負調控作用痰驱。

糖代謝是與葉片衰老相關的另一因素，如糖類直接應用于擬南芥的葉細胞會導致早衰瞳浦。

表型分析－糖

實驗材料：授粉(POL)和不授粉(NPNPOL)的玉米自交系Yu816担映。

發(fā)育時間：吐絲扣6天到21天(DAS)。

參數檢測：葉片的可溶性糖含量和淀粉含量叫潦。

分析結果：

可溶性糖蝇完，6-18 DAS兩種材料中均增加；21 DAS和POL中稍微下降，而NONPL的大量下降短蜕。

淀粉：趨勢與可溶性糖類似氢架，數據如下所示：

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表型分析-葉片形態(tài)和葉綠素分析

• 穗葉和上部的葉片；

• 兩組材料在6-14 DAS時一樣保持綠色朋魔。

• NONPOL組岖研，18 DAS時葉脈積累紅色色素，尖端變黃且干燥警检；21 DAS時穗葉的三分之二變黃缎玫；27 DAS時葉片完全干燥。

• POL組解滓，僅在27 DAS時表現出輕微黃色赃磨。

• 葉綠素含量：

• NONPOL組，穗葉尖端在6-27 DAS顯著下降（相對中部和基部）洼裤，而同時POL組只是稍微一些辭職邻辉。

• 相同的趨勢也發(fā)生在穗葉的中部和基部。

• 在兩組中Chl含量隨著發(fā)育而下降腮鞍，但是NONPOL組比POL組下降得更快值骇，數據如下所示：

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iTAAQ蛋白組實驗設計

樣本數目：7組樣本，8標移国，每個3個生物學重復

實驗材料：玉米自交系Yu816

實驗處理：授粉(POL)吱瘩、不授粉(NONPOL)

取樣部位：葉片

取樣時間點：吐絲后6天(DAS)、14天迹缀、18天和21天

生物學重復：3個

方法與儀器：iTRAQ使碾、LC-MS/MS(Thermo Fisher Scientific, Q-exactive)

流程如下所示：

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蛋白質組整體分析

文章的附件中列出了蛋白質譜的一些數據，得到了959464個廣譜祝懂，其中150650匹配上肽段譜圖票摇，通過Mascot軟件匹配上已知多肽，且28605個匹配上唯一多肽砚蓬。

鑒定了6941個蛋白矢门，其中4371個唯一蛋白時至少有兩個以上肽段匹配的，數據如下所示：

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篩選差異蛋白分析

• 文獻中使用了ANOVA來篩選差異蛋白(DAP)灰蛙，其中閾值為：FC大于1.2或小于0.83(0.83其實就是1.2的倒數)祟剔，p值小于0.05。
• POL組有700個顯著差異積累的蛋白摩梧，NONPOL組有1832個物延；
• 其中261中僅在POL中顯著積累，1393個只在NONPOL組中顯著積累障本，而439個在兩組均顯著積累教届；
• 分析不同時間誘導的衰老：A1 VS B1响鹃， A2 vs B2， A3 VS B3案训；1443個顯著差異積累买置，其中809個僅在NONPOL中顯著差異積累，然后進一步分析在14 DAS强霎、18 DAS和21 DAS的做好心理情況下忿项，以及上下調情況；
• 通過比較本研究和之前文獻報告的玉米自交系B73阻斷授粉誘導衰老的轉錄組研究城舞，發(fā)現兩個數據集僅有154個重疊的基因轩触，這說明在Yu816中有著相對不同的調控機制：

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差異蛋白功能分析—GO和KEGG分析

• 對NONPOL組809個DAP進分別進行GO和KEGG分析，使用cytoscape家夺、Cluego和Cluepedia軟件繪制GO注釋和KEGG網絡圖脱柱；
• 通過評分得到65條邊連接的36個Term， 表明在鑒定的蛋白質相互作用組中相當多的富集(P<0.05)拉馋；
• 顯著富集的Term：光合作用榨为、光合作用光系統(tǒng)II、生長素生物合成過程煌茴、JA代謝過程随闺、器官衰老、絡氨酸代謝蔓腐、脯氨酸生物合成過程矩乐；
• 從亞細胞定位角度來看，顯著寶座的蛋白主要定位于葉綠體回论、光合體系散罕、過氧化酶體和核糖體，如下所示：

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差異蛋白表達分析

表達分析的核心就是熱圖與聚類透葛。

• 在誘導葉片衰老過程中笨使，大多數核糖體蛋白質豐度下降，包括50S核糖體蛋白L5-1(B6SST7)僚害， 其在14 DAS時稍微下降了0.98倍，在18 DAS時下降了0.8倍繁调，但在21 DAS下降到了0.6萨蚕。
• NONPOL組蛋白酶豐度增加，如光胱氨酸蛋白酶1(B6TGM9)在14 DAS增加1.09倍蹄胰，在18 DAS時增加1.43位岳遥，21 DAS時增加到了2.89倍。
• 在差異積累的蛋白質中裕寨，29種與光合作用有關浩蓉，并且大部分光合作用相關蛋白豐度減少派继，例如PSII反應中心蛋白H(P24993)在14 DAS時減少了1.00倍，在18 DAS時為0.72倍捻艳，在21 DAS時為0.46倍驾窟，如下所示：

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• 糖代謝相關的蛋白質在NONPOL組中豐度增加，如淀粉合酶认轨，和葉綠體/淀粉體蛋白（B6U167)在14 DAS時半圓了0.98倍绅络，在18 DAS時增加了1.18倍，21 DAS的1.65倍嘁字；
• 參與ROS過程的蛋白質恩急，抗氧化蛋白質在誘導葉片衰老過程中豐度降低了，例如鐵氧還原蛋白(Q6JAD2)在14 DAs時減少了0.84位纪蜒，在18 DAS時減少了0.76倍衷恭，在21 DAS時減少了0.55倍；
• 但是氧化蛋白質各類如脂氧合酶(Q8W0V2)在14 DAS時增加了0.87倍纯续，在18 DAS時增加了1.78倍匾荆，在21 DAS時增加了2.26倍；
• ABA響應蛋白(B6U8P6)在14 DAS時增加了0.88倍杆烁，在18 DAS時增加了1.32倍牙丽，在21 DAS時增加了1.5倍；但與生長素和赤霉素相關的蛋白質豐度降低兔魂，數據如下所示：

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文章最后使用WB進行驗證烤芦，測序類文章中基本上都要有驗證，這一部分略去不表析校。

文章到此就結束了构罗，整個文獻的數據分析思路如下所示：

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簡化一下就是下圖：

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參考資料

1. iTRAQ標記定量蛋白質組學.輝駿生物
2. iTRAQ(穩(wěn)定同位素標記蛋白質組學技術)
3. iTRAQ? Reagents
4. [iTRAQ/TMT.MtoZ Biolabs Experit in Mass Spectrometry Analysis](iTRAQ/TMT.MtoZ Biolabs Experit in Mass Spectrometry Analysis)
   iTRAQ定量蛋白質組筆記(上)