今天介紹的這一篇文獻(xiàn)[Ref1]，發(fā)表在NC上阀溶，中規(guī)中矩腻脏，分析內(nèi)容很全面也很常見(jiàn)（話說(shuō)，NC上面好多這種描述性的單細(xì)胞文章）银锻。

下面我會(huì)簡(jiǎn)單介紹一下文獻(xiàn)內(nèi)容永品，涉及到以下內(nèi)容，大家可能會(huì)感興趣：

1. 這篇文章是如何鑒定腫瘤細(xì)胞的徒仓？（我之前專門寫過(guò)一篇推文講這個(gè)）
2. 腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞一起降維聚類時(shí)腐碱，需不需要去批次？
3. 腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性可以從哪幾個(gè)角度說(shuō)明掉弛？
4. 腫瘤細(xì)胞的擬時(shí)序/軌跡分析怎么做症见？
5. monocle2的經(jīng)典圖怎么看？
6. 細(xì)胞通訊分析怎么做殃饿？有哪些經(jīng)典的受配體對(duì)谋作？

后臺(tái)回復(fù)20210528獲取完整PPT及文獻(xiàn)原文

1. 背景

我們從標(biāo)題中大概能知道這篇文獻(xiàn)的主要工作是集中在晚期NSCLC的腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境乎芳。去年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌已經(jīng)是我國(guó)發(fā)生率和死亡率最高的癌癥遵蚜。
大家做單細(xì)胞的原因很多時(shí)候都是為了解決異質(zhì)性的問(wèn)題，為什么用藥之后有的人有效而有的人沒(méi)效奈惑，為什么剛開始有效過(guò)段時(shí)間又沒(méi)效吭净，這其中根本的原因就在于異質(zhì)性，腫瘤細(xì)胞本身有異質(zhì)性肴甸，周圍的微環(huán)境也有異質(zhì)性寂殉。最終的愿景是希望在完全了解透這些異質(zhì)性后，能給患者分組原在，每一組給予特定的治療方案友扰。

2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和初步結(jié)果

這張圖顯示了這篇研究的樣本組成彤叉，有肺腺癌 肺鱗癌，有三期 四期村怪，他們是否吸煙秽浇，有無(wú)致癌突變。這個(gè)圖的展示形式還挺清晰的甚负。

左上圖展示了鑒定出來(lái)的11種主要的細(xì)胞類型柬焕，需要注意的是，這里面把Cancer和Epithelial腊敲、Alveolar是區(qū)分開的击喂，也就是說(shuō)腫瘤取樣也可能含有正常的上皮細(xì)胞。這篇文章里面鑒定腫瘤細(xì)胞碰辅，方法非常簡(jiǎn)單懂昂，首先得是上皮細(xì)胞(高表達(dá)EPCAM)，然后不表達(dá)肺部組織正常上皮細(xì)胞的marker没宾。比我之前講的方法簡(jiǎn)單多了凌彬，準(zhǔn)確性如何呢，我持保留意見(jiàn)循衰，不過(guò)下文的CNV熱圖我們可以看到有一些病人所有腫瘤細(xì)胞是幾乎沒(méi)有CNV的铲敛。
左下圖是病人來(lái)源信息，從圖中可以看出会钝，這張圖是沒(méi)有去批次效應(yīng)的伐蒋。原因有兩個(gè)：一是對(duì)于非腫瘤細(xì)胞的亞群，不同病人聚類比較好迁酸，二是在這張圖中先鱼，不想抹掉腫瘤細(xì)胞的腫瘤間異質(zhì)性。這是原文的解釋奸鬓，我也很贊同焙畔，所以當(dāng)你遇到腫瘤細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞一起聚類的情況串远，可以不去批次宏多。非腫瘤細(xì)胞單獨(dú)拿出來(lái)聚類就另說(shuō)了。
右邊兩張圖就比較常規(guī)了澡罚，marker基因熱圖（之前總結(jié)過(guò)展示marker基因的幾種圖伸但，第一篇、第二篇）留搔，細(xì)胞亞群占比更胖。

3. 解析腫瘤異質(zhì)性

3.1 腫瘤間異質(zhì)性

a圖是根據(jù)腺癌、鱗癌，有無(wú)突變分組后函喉，比較CNV（前面寫過(guò)三篇inferCNV相關(guān)的帖子，學(xué)完可以畫出更好看的CNV熱圖）荣月。作者發(fā)現(xiàn)肺腺癌在chromosome 7 and 8q有擴(kuò)增管呵，在chromosome 10有缺失；肺鱗癌在3q有擴(kuò)增哺窄，在5q有缺失捐下。該結(jié)論并不是在所有病人中都成立。
b圖c圖一起看萌业，C圖是說(shuō)這些腫瘤細(xì)胞可以聚成20類坷襟，b圖說(shuō)的是每一個(gè)病人中，每個(gè)cluster的占比生年。從b圖可以看出在多數(shù)的肺腺癌中（圖的右邊1/3的樣本）會(huì)聚到一起（很像）婴程，并且每個(gè)病人中只有一個(gè)主要的cluster；而肺鱗癌病人之間沒(méi)有那么像抱婉，并且好幾個(gè)病人有多個(gè)cluster档叔。這說(shuō)明肺鱗癌有更高的腫瘤間異質(zhì)性，以及更高的克隆性蒸绩。
這一部分是腫瘤間異質(zhì)性：腺癌鱗癌之間衙四，病人之間。

3.2 腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

為了定量腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性(ITH)患亿，作者定義了兩個(gè)ITH分?jǐn)?shù)传蹈，一個(gè)基于表達(dá)矩陣得到ITH_GEX，一個(gè)基于inferCNV輸出的矩陣得到ITH_CNA步藕。在矩陣中惦界，所有細(xì)胞兩兩之間算一個(gè)相關(guān)系數(shù)，對(duì)于這些數(shù)值的分布漱抓，0.75分位數(shù)減去0.25分位數(shù)就得到這個(gè)分?jǐn)?shù)表锻。左圖顯示這兩個(gè)ITH分?jǐn)?shù)有一定的相關(guān)性，但不強(qiáng)乞娄，因?yàn)镃NV雖然可以影響基因表達(dá)瞬逊，但基因表達(dá)還受很多其他因素的調(diào)控，比如TF仪或、小RNA确镊、點(diǎn)突變、與周圍環(huán)境的細(xì)胞互作等等范删。
右圖比較了不同分組之間的ITH分?jǐn)?shù)蕾域。

4. 正常上皮細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞的軌跡分析

關(guān)于腫瘤細(xì)胞的擬時(shí)序，我見(jiàn)過(guò)正常上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞放在一塊來(lái)分析的，幾乎沒(méi)有見(jiàn)過(guò)腫瘤細(xì)胞單獨(dú)做擬時(shí)序旨巷，而且我也覺(jué)得這樣做沒(méi)什么道理巨缘，我覺(jué)得腫瘤細(xì)胞不同狀態(tài)是一種優(yōu)勝劣汰的關(guān)系，不同狀態(tài)之間是否會(huì)相互轉(zhuǎn)變感覺(jué)不是很明確（我沒(méi)說(shuō)EMT, CSC這種線性的轉(zhuǎn)變）采呐，所以即使做了擬時(shí)序結(jié)果也不一定可靠若锁。

• 如果正常上皮細(xì)胞之間的發(fā)育軌跡已經(jīng)清楚，將其作為參考斧吐，和腫瘤細(xì)胞一起做軌跡分析又固，可以知道正常上皮細(xì)胞發(fā)育的哪些階段更容易發(fā)展成腫瘤細(xì)胞（其實(shí)這種情況，從表達(dá)譜相似性也能看出來(lái)煤率，之所以還要這么做仰冠，可能是因?yàn)榇蠹矣X(jué)得軌跡分析看上去高大上一些），比如Ref2中的Fig. 2b蝶糯；
• 如果正常上皮細(xì)胞（多種）向腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的關(guān)系已經(jīng)清楚洋只，通過(guò)做軌跡分析，可以完善已知路徑昼捍，明確幾種正常上皮細(xì)胞是如何發(fā)展成腫瘤細(xì)胞的木张，可能是獨(dú)立的，也可能存在中間狀態(tài)端三；也可以同上面一樣舷礼，看看別的上皮細(xì)胞是否也容易發(fā)展成腫瘤細(xì)胞。

這篇文章是第二種情況郊闯，以圖中肺鱗癌為例妻献。已知basal cells和club cells可以發(fā)展成LUSC腫瘤細(xì)胞，做完monocle2發(fā)現(xiàn)club cells處在更末端的位置团赁，basal cells處在靠近c(diǎn)lub cells的枝干上育拨，腫瘤細(xì)胞分布在其余位置，因此可以將已知的路徑改寫成：basal cells似乎是club cells向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)（原文似乎這個(gè)詞用得太好了欢摄，沒(méi)把話說(shuō)絕熬丧，也省了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我學(xué)廢了）怀挠。

5. Th17和Treg潛在的轉(zhuǎn)變

文章說(shuō)這是首次在肺癌中找到Th17細(xì)胞亞群析蝴，并揭示了Th17和Treg潛在的轉(zhuǎn)變關(guān)系（之前已經(jīng)被報(bào)道過(guò)）。
d圖是用Slingshot做的绿淋，顏色深淺表示擬時(shí)序的先后闷畸，Th17和Treg之間被連起來(lái)，說(shuō)明存在轉(zhuǎn)換關(guān)系吞滞。
右邊的分支圖和熱圖是monocle2畫的佑菩，之前剛學(xué)monocle2的時(shí)候盾沫，比較疑惑的是熱圖里面的fate1和fate2分別表示什么，這張圖就說(shuō)得很清楚了殿漠。從你想研究的節(jié)點(diǎn)（圖中的1節(jié)點(diǎn)）到根（一般是人為指定赴精，圖中是CD4 naive對(duì)應(yīng)的狀態(tài)）都是pre-branch，然后沿著擬時(shí)序的方向（跟你指定的根狀態(tài)有關(guān)）绞幌，右邊的枝是fate1（對(duì)應(yīng)圖中的增殖細(xì)胞）祖娘，左邊的枝是fate2（對(duì)應(yīng)Treg細(xì)胞）。熱圖里面選了一些pre-branch啊奄、fate1、fate2對(duì)應(yīng)細(xì)胞的差異基因來(lái)呈現(xiàn)掀潮，從熱圖中間向兩邊看菇夸，能看到不同的fate表達(dá)不同的基因。文中說(shuō)仪吧，從圖中可以看出Th17是沿著naive到Treg的中間狀態(tài)庄新。
結(jié)合這兩種方法，得出Th17和Treg有潛在的轉(zhuǎn)變關(guān)系薯鼠。

6. TME中的免疫細(xì)胞組成

在解析了腫瘤細(xì)胞择诈、重要免疫細(xì)胞之后，作者又看了每個(gè)病人中細(xì)胞亞群的占比出皇，并探究了哪些因素能影響細(xì)胞占比羞芍。

file

a圖是說(shuō)，不同的分組影響中性粒細(xì)胞的占比郊艘，文章是將中性粒細(xì)胞作為一種免疫抑制的亞群來(lái)說(shuō)的荷科。
d圖是說(shuō)，隨著異質(zhì)性分?jǐn)?shù)的增加纱注，幾種免疫抑制的亞群占比增加畏浆，漿細(xì)胞亞群占比減少。（漿細(xì)胞分泌抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用狞贱，可以通過(guò)介導(dǎo)NK細(xì)胞刻获，或是激活補(bǔ)體系統(tǒng)等途徑，不過(guò)抗腫瘤免疫平時(shí)說(shuō)得比較多的還是T細(xì)胞殺傷這種細(xì)胞免疫方式瞎嬉。）
因此作者得出結(jié)論蝎毡，認(rèn)為ITH升高，會(huì)增加免疫抑制微環(huán)境氧枣，降低腫瘤殺傷能力顶掉。

7. 細(xì)胞通訊分析

文章的最后一部分講的是細(xì)胞通訊，雖然作者說(shuō)不同的分組有不同的細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)挑胸，但從文中給的圖來(lái)看痒筒，幾組都整體差不多，有個(gè)別差異。
如果用過(guò)cellphoneDB簿透，會(huì)發(fā)現(xiàn)輸出結(jié)果里面有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的受配體對(duì)很多很多移袍，之前比較兩組的受配體對(duì)，試過(guò)肉眼比較兩張大熱圖一個(gè)一個(gè)看老充，太花時(shí)間了葡盗，后來(lái)就干脆提前整理好想要比較的受配體對(duì)（文章里面經(jīng)常出現(xiàn)的受配體對(duì)就那些），直接從輸出文件里面提取啡浊，省事很多觅够。
比如，我圖中圈出來(lái)的幾個(gè)巷嚣，

1. 趨化因子及其受體喘先，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞會(huì)招募中性粒細(xì)胞這種免疫抑制的亞群；
2. VEGFA相關(guān)的受配體廷粒，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞會(huì)促進(jìn)血管生成（內(nèi)皮細(xì)胞）窘拯，保證自身營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；
3. Treg表達(dá)CTLA4分子坝茎，巨噬細(xì)胞（作為抗原提呈細(xì)胞APC）表達(dá)CD86涤姊，二者結(jié)合，那么能給CD8提供抗原的APC就少了嗤放，從而減少CD8的激活思喊；
4. 耗竭性CD8 T細(xì)胞表達(dá)CTLA4是一個(gè)特征，與APC表達(dá)的CD86結(jié)合后次酌，啟動(dòng)抑制性信號(hào)搔涝。

8. 總結(jié)

最后總結(jié)一下，我覺(jué)得的這篇文章的亮點(diǎn)：

• 填補(bǔ)了晚期非小細(xì)胞肺癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域的空白
• 文章第一次在NSCLC中發(fā)現(xiàn)了Th17和措，并揭示了Th17和Treg的潛在轉(zhuǎn)變關(guān)系
• 從多個(gè)角度解析了腫瘤的異質(zhì)性（腫瘤間庄呈、腫瘤內(nèi)都做了分析）
• ITH與免疫抑制微環(huán)境的關(guān)系

9. Ref

1. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer
2. Lee, H. O., et al. (2020). "Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer." Nat Genet 52(6): 594-603.

OK啦，這篇文獻(xiàn)就說(shuō)到這里派阱，歡迎三連哈~

因水平有限诬留，有錯(cuò)誤的地方，歡迎批評(píng)指正贫母！