在經(jīng)過一段時間對單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)技術(shù)的了解万俗，我認為對兩項技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用有了一定的認知。本周我選擇從植物領(lǐng)域入手蝶俱，選擇了華大在今年五月份于Developmental Cell在線發(fā)表的擬南芥葉片空間單細胞的一個關(guān)聯(lián)分析研究瘦馍。接下來我?guī)Т蠹乙黄鹫J知和解讀這篇文獻吧碳褒。
一歹撒、文章簡介
文章題目：單細胞空間轉(zhuǎn)錄組測序揭示擬南芥葉片中特定區(qū)域的細胞亞型和轉(zhuǎn)錄組圖譜
期刊：Developmental Cell?IF：13.417
發(fā)表機構(gòu)：深圳華大生命科學(xué)研究院
二莲组、主要內(nèi)容
研究者通過對6周齡的擬南芥莖生葉進行了取樣、實驗和測序分析暖夭，在驗證scStereo-seq技術(shù)在植物樣本中應(yīng)用的可靠性的同時锹杈，分析了擬南芥葉片中不同基因的空間表達變化以及不同細胞群體的空間發(fā)育軌跡，描繪了葉片中不同細胞類型的轉(zhuǎn)錄組空間變化迈着。
研究的內(nèi)容主要包括以下幾點：
l 利用stero-seq技術(shù)建立植物單細胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜
l 鑒定細胞亞型和細微的轉(zhuǎn)錄差異
l 從主脈到葉緣細胞類型差異基因的表達
l 構(gòu)建擬南芥空間圖譜來分辨維細胞發(fā)育軌跡
三竭望、材料與方法
研究樣本：樣本為6周齡的擬南芥莖生葉，擬南芥品種為野生型Columbia-0寥假。
研究策略：基于華大自主研發(fā)的時空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq市框，深圳華大生命科學(xué)研究院結(jié)合植物樣本擁有細胞壁這一特性霞扬，針對技術(shù)流程進行了優(yōu)化和改良糕韧，建立了一套適用于植物的單細胞級的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)流程scStereo-seq，并將其示范應(yīng)用于擬南芥葉片的時空組學(xué)研究中喻圃。
Stereo-seq技術(shù)的建立和應(yīng)用（圖1）：
① CID經(jīng)滾環(huán)擴增后形成DNA納米球（DNB）
②DNB落入芯片上的spot位點萤彩，經(jīng)測序得到CID序列及空間坐標
③ 通過生化合成將CID與MID分子和捕獲探針（Oligo-dT）相連接
④ 組織切片貼片后透化并釋放mRNA
⑤ 芯片對組織上的mRNA進行原位捕獲，經(jīng)擴增后建庫測序
圖1 scStereo-seq技術(shù)原理示意圖
實驗方法：
① 對擬南芥葉片進行冷凍切片斧拍，使用直徑為220nm, 間距為715nm的DNA納米球（DNB）陣列來捕獲mRNA信息雀扶。
② 對切片進行細胞壁染色呈像，使用stereo-seq技術(shù)對11片葉子進行測序?qū)嶒灐?/p>
③ 確認測序確認質(zhì)量達到要求肆汹，MID 的分布可以在組織區(qū)域和背景區(qū)域間明顯區(qū)分開來愚墓。
④ 對細胞壁進行了甲苯胺藍(TB)染色，以顯示細胞間的邊界昂勉。
⑤ 將染色圖像和測序數(shù)據(jù)合并浪册，利用套索工具根據(jù)細胞壁邊界手工提取單細胞，并與MID計數(shù)相配合岗照，獲得每個單細胞的具體數(shù)據(jù)村象。
四笆环、研究結(jié)果
1、scStereo-seq技術(shù)的建立和應(yīng)用
基于Stereo-seq技術(shù)厚者，研究者建立了適用于植物的單細胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（scStereo-seq）躁劣，并將其應(yīng)用于植物葉片樣本研究中（圖2A）。通過取樣库菲、實驗和分析篩選账忘，研究人員篩選出來26個擬南芥葉片樣本進行了整合以及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集的構(gòu)建，通過質(zhì)控和過濾蝙昙，總共獲得了13,950個單細胞數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析闪萄，包括5,139個表皮細胞、7,490個葉肉細胞奇颠、377個保衛(wèi)細胞和944個維管束細胞败去。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2 擬南芥莖葉單細胞水平空間轉(zhuǎn)錄組的分析
2、單細胞水平上鑒別細胞類型間的轉(zhuǎn)錄組差異
在獲得高質(zhì)量高數(shù)據(jù)量的葉片空間數(shù)據(jù)（圖2A）后烈拒，研究者首先對scStereo-seq技術(shù)在植物樣本中應(yīng)用的可靠性進行了驗證圆裕。通過marker基因的檢驗和可視化、單細胞聚類分析荆几、主要細胞類型鑒定和功能分析等方法多方面地進行了分析吓妆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)scStereo-seq技術(shù)能夠提供高清的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組特征，對不同細胞類型的鑒定具有較高的分辨率（圖3C吨铸、2E行拢、2F）。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖3 不同細胞類型的技術(shù)再現(xiàn)性和轉(zhuǎn)錄組多樣性
3诞吱、評估scStereo-seq技術(shù)在植物樣本中應(yīng)用的可靠性
在過往的植物單細胞研究中舟奠，部分細胞亞型特征高度相似而難以通過單細胞等技術(shù)得到有效地區(qū)分和研究（如表皮細胞中的上、下表皮細胞房维，葉肉細胞中的柵欄細胞和海綿細胞）沼瘫，而scStereo-seq技術(shù)可以在獲得單細胞空間表達數(shù)據(jù)的同時，根據(jù)切片的圖像信息對切片樣本中形態(tài)清晰的細胞進行鑒定和注釋咙俩。通過將空間信息與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合分析耿戚，成功將表達相似的上、下表皮細胞（圖4C）阿趁，以及柵欄細胞膜蛔、海綿細胞區(qū)分開來，并對這些相似細胞類型間的差異和功能（圖4D脖阵、4E）進行了研究皂股。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖4 細胞類型和細胞亞型轉(zhuǎn)錄組特征的驗證和研究
4、解析從主脈到葉緣細胞類型差異基因的表達
為了探究基因的空間表達差異独撇，研究人員從葉片中間向兩端的方向劃分成了4個區(qū)域（0區(qū)為主葉脈屑墨，3區(qū)為葉邊緣）躁锁，并以此為基礎(chǔ)在細胞中進行了基因表達模式分析（圖5A），結(jié)果表明卵史，光合作用效率從主葉脈到葉緣逐漸增加战转，而主葉脈的主要角色是與物質(zhì)運輸相關(guān)（圖5B~4D）。鑒于光合作用過程主要發(fā)生在葉肉細胞當中以躯，研究人員又進一步對葉肉細胞中的基因表達模式進行了分析槐秧，分析結(jié)果與之前的分析一致。有意思的是忧设，葉肉細胞的pattern2和pattern 3的基因顯著富集于物質(zhì)運輸與高滲機械刺激等反饋相關(guān)的GO中刁标，表明0區(qū)的葉肉細胞與維管細胞之間可能存在較為頻繁的物質(zhì)交換（圖5E~5G）
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖5 擬南芥葉片橫截面上的基因表達模式
5、解析不同類型細胞的空間發(fā)育軌跡
已有研究表明址晕，葉脈與葉邊緣的細胞存在分化上的差異膀懈，但不同類型細胞的具體發(fā)育模型還不清楚，通過擬時序分析谨垃，研究人員發(fā)現(xiàn)在維管細胞中启搂，主葉脈區(qū)域的細胞相較于葉緣其分化程度更低，擁有更高的多功能干性（圖6A~6C）刘陶。而在表皮和保衛(wèi)細胞中胳赌，保衛(wèi)細胞顯著富集于發(fā)育軌跡的一支，但它們在空間上沒有表現(xiàn)出明顯差異（圖6D~6F）匙隔。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖6 血管細胞和保衛(wèi)細胞的空間分辨發(fā)育軌跡
五疑苫、研究總結(jié)
這篇文章總體而言是一篇技術(shù)推廣文章。主要目的是證明了華大開發(fā)的scStereo-seq時空轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的可用性纷责。通過在擬南芥葉片中運用scStereo-seq技術(shù)捍掺，證明單細胞分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)其有利于細胞類型的識別和細胞轉(zhuǎn)錄特征的鑒定。其中利用空間信息和基于圖像的單細胞分割有利于細胞亞群的鑒定碰逸，給我們在植物上將單細胞和空間技術(shù)進行整合提供了借鑒乡小。
