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2020年《Nature Methods》雜志將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)評(píng)選為Method of the year运敢，時(shí)至今日瑰钮，空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用已然如浪潮一般链峭，滾滾而來(lái)盹牧。
2022年5月4日通危，Cell雜志及其子刊Development Cell以專題形式發(fā)表了4篇基于Stereo-seq技術(shù)的空間轉(zhuǎn)錄組文章，專題名稱為時(shí)空組學(xué)聯(lián)盟：SpatioTemporal Omics Consortium (STOC)蜈垮，而Stereo-seq技術(shù)正是華大自主研發(fā)的耗跛。
本文對(duì)Stereo-seq技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，并展示4篇文章（小鼠攒发、斑馬魚调塌、擬南芥、果蠅）的主要結(jié)果晨继。
Stereo-seq簡(jiǎn)介
Stereo-seq（spatial enhanced resolution omics-sequencing）技術(shù)基于DNB（DNA nanoball）陣列芯片和原位捕獲技術(shù)研發(fā)的具有更高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)烟阐。技術(shù)原理如下：
- Generation of Stereo chips：合成隨機(jī)的25nt序列作為空間坐標(biāo)barcode （coordinate identity搬俊，CID）紊扬，以及5 '磷酸化的DNB文庫(kù)oligo序列，并鏈接在一起唉擂，經(jīng)過滾動(dòng)擴(kuò)增復(fù)制餐屎，形成DNB。DNB隨后結(jié)合到Stereo chip上玩祟，并落入芯片中數(shù)十億規(guī)則排列的Spot上腹缩。通過DNBSEQ測(cè)序儀對(duì)DNB進(jìn)行測(cè)序，獲取CID序列及對(duì)應(yīng)的空間坐標(biāo)空扎。然后將22nt的poly-T序列和10nt的UMI序列和CID連接（圖1A藏鹊，step1-step3）。
- 將10μm厚度的冷凍包埋組織切片貼在捕獲芯片的表面转锈，經(jīng)過胃蛋白酶透化盘寡，釋放的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增撮慨、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序竿痰，通過CID序列還原mRNA分子的空間位置（圖 1A脆粥，step4-step6）。
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納米級(jí)分辨率
芯片中每個(gè)Spot點(diǎn)的直徑約為220nm影涉，兩個(gè)Spot點(diǎn)的中心點(diǎn)的距離為500nm或者715nm变隔。x相比于其他方法，Stereo-seq每100μm2有更多的spots蟹倾，spot尺寸和中心到中心的距離更小匣缘，因此分辨率更高。
但是這里存在一個(gè)問題：一個(gè)中等大小的細(xì)胞約10μm喊式，如此小的spot如何代表細(xì)胞呢孵户？
- 首先，文章中提到Spatially constrained clustering (SCC)的聚類方法岔留，該方法可以將多個(gè)spot分bin夏哭，以bin為單位進(jìn)行聚類，用于組織學(xué)注釋献联。bin14(14 x 14 DNB)相當(dāng)于一個(gè)10μm的細(xì)胞竖配。
- 然后，將核酸染色圖片和Stereo-seq芯片比對(duì)里逆，使用Scikit-image包進(jìn)行細(xì)胞分割分析进胯，劃分成一個(gè)個(gè)segmented cells，并生成cell x gene矩陣原押，用于下游細(xì)胞注釋胁镐。
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厘米級(jí)全景視野
最大有效捕獲面積可達(dá)13cm x 13cm，可以對(duì)大尺寸組織器官進(jìn)行全景圖譜的繪制诸衔。
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技術(shù)缺陷
- Stereo-seq的高分辨率允許高效的基于圖像的細(xì)胞分割盯漂，但在某些情況下，多個(gè)細(xì)胞類型彼此接近笨农，特別是較小的細(xì)胞類型就缆，如免疫細(xì)胞，細(xì)胞分割可能是不完美的谒亦。
- Stereo-seq具有全基因組覆蓋竭宰，但由于捕獲的局限性，可能會(huì)漏掉相關(guān)低表達(dá)基因份招。比如果蠅文獻(xiàn)中提到的腸干細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞切揭，這些類型的細(xì)胞marker基因表達(dá)水平低。
Cell：Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays
小鼠時(shí)空?qǐng)D譜：
- 為了證明Stereo-seq的魯棒性并證明其具有細(xì)胞分辨率解剖組織的能力锁摔，對(duì)成年小鼠冠狀半腦切片進(jìn)行圖譜繪制廓旬。證明了Stereo-seq數(shù)據(jù)既可以通過基于bin的聚類識(shí)別大組織中的功能解剖區(qū)域，也可以通過圖像引導(dǎo)的細(xì)胞分割識(shí)別細(xì)胞類型鄙漏。
- 構(gòu)建了小鼠器官發(fā)生時(shí)空?qǐng)D譜嗤谚，及時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)MOSTA棺蛛。除此之外，得益于高密度信號(hào)巩步，還可以從選定的組織中進(jìn)行bin的重聚類旁赊，比如文章在E13.5脊髓組織中，確定了 ventricular zone (Hopx+), marginal zone (Slc5a7+), basal plate (Vsnl1+）等椅野。
描繪小鼠胚胎組織細(xì)胞類型的空間異質(zhì)性终畅。比如文章中上皮細(xì)胞(Epcam+， Krt8+)可分為特殊上皮細(xì)胞亞型竟闪，包括肺中的hair follicle cells(Krt5+离福， Krt17+)，, alveolar type II cells (Foxp2+炼蛤，Nkx2-1+)妖爷，腎上腺皮質(zhì)中的 zona glomerulosa epithelial cells(Akr1b7+， Star+)理朋，唾液腺中的 glandular epithelium (Gstm1+, Wfdc18+)絮识，等等。
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E16.5大腦的細(xì)胞異質(zhì)性嗽上。不同解剖區(qū)域聚類識(shí)別了不同類型的祖細(xì)胞次舌，神經(jīng)元，非神經(jīng)元細(xì)胞等兽愤。放大到端腦進(jìn)行更詳細(xì)的分析彼念，背側(cè)皮層腦室區(qū)產(chǎn)生谷氨酸能神經(jīng)元，這些神經(jīng)元分布在大腦皮層和海馬區(qū)浅萧。側(cè)逐沙、內(nèi)側(cè)和尾側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起的腹室區(qū)產(chǎn)生GABAergic中間神經(jīng)元，這些神經(jīng)元分布于紋狀體和蒼白球惯殊，并遷移到大腦皮層酱吝。
E16.5 Stereo-seq圖譜清晰地識(shí)別了神經(jīng)元間祖細(xì)胞標(biāo)記(Dlx1+也殖， Dlx2+土思，Lhx6 + Nkx2-1 +) 中神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)和中間神經(jīng)元進(jìn)入大腦皮層的遷移軌跡。 空間RNA速度分析顯示忆嗜，中間神經(jīng)元從MGE向大腦皮層的切向遷移具有很強(qiáng)的方向性流動(dòng)己儒。
MOSTA在解剖哺乳動(dòng)物遺傳疾病的發(fā)育起源方面可能特別有用。為了證明這一點(diǎn)捆毫，選取了2429種疾病闪湾，及1959個(gè)在數(shù)據(jù)中表達(dá)的基因，描述了人類發(fā)育缺陷基因在小鼠胚胎中的表達(dá)模式绩卤。文章著重研究了WNT5A基因突變導(dǎo)致的Robinow Syndrome途样，觀察到Wnt5a在上頜骨的間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中高表達(dá)江醇，而在肢體中，它主要位于間充質(zhì)細(xì)胞中何暇，這表明兩種組織的疾病機(jī)制可能不同陶夜。MOSTA可用于定義發(fā)育過程中疾病相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)空窗口，并可用于建立潛在的缺陷裆站。
Developmental Cell：Spatiotemporal mapping of gene expression landscapes and developmental trajectories during zebrafish embryogenesis
斑馬魚時(shí)空?qǐng)D譜：
- 斑馬魚受精后（hpf）不同發(fā)育階段的胚胎包括3.3条辟、5.25、10宏胯、12羽嫡、18、24小時(shí)肩袍，用于空間轉(zhuǎn)錄組分析杭棵。冷凍切片厚度15微米，Stereo-seq芯片氛赐，spot大小為220nm颜屠，中心距離715nm，芯片大小1cm2鹰祸。在bin15下甫窟，構(gòu)建斑馬魚胚胎時(shí)空轉(zhuǎn)錄圖譜ZESTA（https://db.cngb.org/stomics/zesta/）。
從18和24-hpf中提取神經(jīng)成分蛙婴，構(gòu)建神經(jīng)系統(tǒng)的空間圖譜粗井。結(jié)果發(fā)現(xiàn)后腦NSCs在前向和后向以及背向和腹向表現(xiàn)出非同步分化。
使用hotspot鑒定相似空間分布的共變基因集街图。24-hpf共鑒定19個(gè)modules浇衬，且和空間集群表現(xiàn)出一致性。其中M12在24-hpf胚胎中擴(kuò)散到各種簇餐济，包括色素細(xì)胞耘擂、紅系細(xì)胞和感覺器官。通過string數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析絮姆，發(fā)現(xiàn)TF基因sox10與來(lái)自這些細(xì)胞類型和器官的基因強(qiáng)相互作用醉冤。數(shù)據(jù)集為探索不同空間區(qū)域之間的基因相互作用提供了強(qiáng)大的工具。
使用monocle2進(jìn)行單細(xì)胞數(shù)據(jù)的軌跡分析篙悯，使用SPOTlight解析每個(gè)bin中的細(xì)胞類型比例蚁阳，揭示了不同發(fā)育軌跡的空間動(dòng)力學(xué)特征。通過整合Stereo-seq和scRNA數(shù)據(jù)鸽照，揭示了斑馬魚早期胚胎發(fā)生過程中精確的細(xì)胞分辨率螺捐、時(shí)空發(fā)育軌跡以及潛在的調(diào)控因子。
計(jì)算通過不同配體-受體對(duì)之間的相對(duì)距離，鑒定潛在的互作對(duì)定血，平均相對(duì)距離小于5個(gè)bin的認(rèn)為具有強(qiáng)潛在相互作用赔癌。發(fā)現(xiàn)有21對(duì)配體-受體通過了這些嚴(yán)格的過濾，包括一些Notch配體和受體(圖5B)澜沟，說明了這些配體-受體對(duì)的關(guān)鍵作用届榄。以Notch通路的綜合分析為例，為研究不同信號(hào)通路的動(dòng)力學(xué)提供了有用的數(shù)據(jù)庫(kù)倔喂，以及潛在的發(fā)育調(diào)控機(jī)制铝条。
Developmental Cell：The single-cell stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves
擬南芥時(shí)空?qǐng)D譜：
- 10μm莖生葉冷凍切片，放置在四個(gè)獨(dú)立的芯片上席噩，每個(gè)芯片7個(gè)葉片樣本班缰。spot大小220nm，中心距離500nm悼枢，bin20埠忘。根據(jù)葉片的組織學(xué)特征和空間信息，將13950個(gè)細(xì)胞劃分為5139個(gè)表皮細(xì)胞(上表皮細(xì)胞2,898個(gè)馒索，下表皮細(xì)胞2,241個(gè))莹妒，葉肉細(xì)胞7,490個(gè)(柵欄細(xì)胞4,254個(gè)，海綿狀葉肉細(xì)胞3,236個(gè))绰上，保衛(wèi)細(xì)胞377個(gè)旨怠，維管細(xì)胞944個(gè)。
- 擬南芥葉片的表皮可分為上表皮細(xì)胞和下表皮細(xì)胞蜈块，葉肉細(xì)胞也可分為海綿狀葉肉細(xì)胞和柵欄狀葉肉細(xì)胞鉴腻。然而，由于細(xì)胞亞型之間的轉(zhuǎn)錄組高度相似百揭，以往的scRNA-seq數(shù)據(jù)和分析單獨(dú)無(wú)法區(qū)分這些細(xì)胞亞型爽哎，結(jié)合空間信息可以很輕松的劃分亞型，表明了Stereo-seq技術(shù)在植物葉片細(xì)胞類型進(jìn)一步劃分亞型的優(yōu)勢(shì)器一。
- 除了細(xì)胞亞型之間的功能差異外课锌，在葉片特定區(qū)域特異表達(dá)的基因在植物的各種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。文章將葉片主脈區(qū)劃分為0區(qū)祈秕，將主脈兩側(cè)的區(qū)域劃分為3個(gè)區(qū)域渺贤，分別為1、2踢步、3區(qū)癣亚，參與光合作用的代表性基因包括LHCB6丑掺、LHCB1.2和LHCB1.3從主脈到葉緣的表達(dá)均增加获印，但運(yùn)輸相關(guān)基因如ROG1、ERD15和GAPC2的表達(dá)則降低。另外兼丰，通過不同區(qū)域的基因表達(dá)模式分析玻孟，表明空間基因表達(dá)模式對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用，對(duì)從空間角度理解植物葉片復(fù)雜功能提供了線索鳍征。
- 眾所周知黍翎，相對(duì)于更中間的區(qū)域，在葉片邊緣的分化是減速的艳丛，對(duì)維管細(xì)胞的軌跡分析結(jié)果也證明了這一點(diǎn)匣掸。但是表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞的軌跡分析結(jié)果并不是這樣。本研究揭示的發(fā)育階段空間信息可為進(jìn)一步研究維管細(xì)胞特殊發(fā)育階段提供重要參考氮双。
Developmental Cell：High-resolution 3D spatiotemporal transcriptomic maps of developing Drosophila embryos and larvae
果蠅時(shí)空?qǐng)D譜：
- 胚后期(產(chǎn)卵后14-16 h和16-18 h碰酝，對(duì)應(yīng)胚胎發(fā)生的16-17階段，分別稱為E14-16和E16-18)和幼蟲全部三個(gè)階段(L1-L3)戴差，制作7μm和10μm切片送爸。L1、L2暖释，bin20袭厂，L3，bin50球匕。
構(gòu)建3D時(shí)空?qǐng)D譜纹磺。簡(jiǎn)單地說，先從可視化的Stereo-seq表達(dá)矩陣中提取2D圖形區(qū)域亮曹，并根據(jù)形狀和轉(zhuǎn)錄組相似性對(duì)其進(jìn)行排列澈侠，從而為每個(gè)bin指定一個(gè)x-y-z 3D坐標(biāo)鹿霸。然后最小化每個(gè)部分的批處理效果，并在相鄰的片中合并具有相同注釋的簇。三維簇的輪廓和位置與胚胎和幼蟲的解剖結(jié)構(gòu)相似跟伏。
胚胎和幼體中腸的區(qū)域化。近十年來(lái)瑰谜，研究發(fā)現(xiàn)成蟲中腸含有不同細(xì)胞形態(tài)和生理功能的亞區(qū)锌历。使用hotspot在5個(gè)階段的樣本中識(shí)別空間上不同、功能上不同的基因模塊蹄葱。揭示了果蠅發(fā)育過程中消化道功能基因的氏义。動(dòng)態(tài)時(shí)空特征，并為胚胎發(fā)生過程中中腸區(qū)帶的變化提供了線索图云。
幼蟲睪丸的空間細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)惯悠。進(jìn)一步細(xì)分L3睪丸細(xì)胞，bin15竣况，以已發(fā)表的單細(xì)胞幼蟲睪丸數(shù)據(jù)集為參考克婶，根據(jù)每個(gè)細(xì)胞類型的評(píng)分進(jìn)行注釋，鑒定了精子發(fā)生過程中的各種細(xì)胞類型，包括不同階段的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞情萤。從mRNA豐度變化鸭蛙，UMAP圖及RNAvelocity結(jié)果都表明了，在幼蟲睪丸筋岛，從精原細(xì)胞到早期初級(jí)精母細(xì)胞再到晚期初級(jí)精母細(xì)胞的強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)變娶视。
果蠅發(fā)育過程中調(diào)控活動(dòng)的空間模式。在發(fā)育過程中睁宰，細(xì)胞異質(zhì)性的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)力是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRNs)的變化肪获，由轉(zhuǎn)錄因子(tf)、輔助因子及其下游靶基因的相互作用介導(dǎo)柒傻。發(fā)現(xiàn)CG16779在胚胎和幼蟲樣品中具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性調(diào)控活性贪磺，暗示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有潛在的調(diào)控功能。
