胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種致命的疾病版保，在治療上體現(xiàn)出很高的耐藥性蚕泽。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)在PDAC中起關(guān)鍵作用次洼，但其多樣性阻止了治療性開發(fā)觅捆。文章指出蝉衣，可以通過阻斷PGE2或IL-1β+活性進行TAM重編程肪凛，抵消腫瘤內(nèi)外的炎癥劳景，從而控制PDAC進展配紫。

雷納托·奧斯圖尼(Renato Ostuni)视搏，就職于意大利圣拉斐爾特里松基因療法研究院 (San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy in Italy)审孽，在博士期間為發(fā)現(xiàn)CD14作為炎癥細(xì)胞對細(xì)菌分子LPS的生化和細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子做出了貢獻(Nature 2009、Cell 2011浑娜、JCI 2012)佑力。后發(fā)現(xiàn)一類控制活化巨噬細(xì)胞中短期轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳免疫記憶的調(diào)節(jié)元件——潛伏增強子(Cell 2013)。目前筋遭，Ostuni任先天免疫系統(tǒng)基因組學(xué)組組長打颤，其團隊致力于巨噬細(xì)胞激活的基因組控制(Nature Immunology，2017年)和人類先天免疫系統(tǒng)的發(fā)育漓滔。

1. Identification of IL-1β+ TAMs in PDAC

Fig 1a-c： 作者對新鮮分離的來自naive 或 chemotherapy treated PDAC 患者腫瘤組織進行了單細(xì)胞測序编饺，得到了59,569個細(xì)胞(Extended Data Fig. 1a,b)。作者對TAM進行了2次聚類响驴，得到6個亞群透且。其中IL1β+TAM顯著富集到炎癥反應(yīng) (IL1B, TNF, NLRP3 and PTGS2)，白細(xì)胞招募 (CXCL1, CXCL2 and CCL3) 和血管生成 (VEGFA, THBS1 and PDGFB) programmes豁鲤，但是IFN和抗原呈遞通路則顯著下調(diào)秽誊。
Fig 1d：隨后作者構(gòu)建了IL-1β+ TAMs signature，在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢測了其表達情況琳骡，發(fā)現(xiàn)IL-1β+ TAMs signature的高表達與PDAC患者更差的預(yù)后顯著相關(guān)锅论。
These data uncover IL1β+ TAMs as a subset of PDAC macrophages expressing inflammatory and non-cytotoxic programmes, whose abundance correlates with poor prognosis.

2. IL-1β+ TAMs are conserved in mouse PDAC

隨后作者對PDAC小鼠模型(Kras^G12D/+ Trp53^R172H/+ Pdx1^Cre/+ , KPC)不同時間點的外周血，胰腺日熬，腫瘤組織進行了單細(xì)胞測序棍厌。注釋結(jié)果顯示與人PDAC的TAM細(xì)胞群非常相似。
Fig 1e： 結(jié)果顯示Il1b+ TAMs 在小鼠 PDAC 中早期即存在并且長期持續(xù)存在竖席。
Fig 1f： 流式驗證了PDAC組織中這群細(xì)胞的存在耘纱。
Fig 1g： 小鼠 IL-1β+ TAMs 表達 CD64, CD11c, MHCII 和共刺激分子 CD80 和 CD86, 以及腫瘤中的免疫失調(diào)marker 如CD206，ARG1和免疫檢查點抑制劑PD-L1毕荐。
Thus, IL-1β+ TAMs are a conserved macrophage population that co-expresses inflammatory and immune inhibitory markers.

Fig 1

3. A monocytic origin of IL-1β+ TAMs

Fig 2a, b： 隨后作者整合了外周血束析、胰腺和腫瘤的數(shù)據(jù)，以探究了IL-1β+ TAMs的來源憎亚。CellRank結(jié)果顯示IL-1β+ TAM是外周來的员寇，而不是原位TAM分化的。
Fig 2c： 在小鼠和人PDAC中第美，單核細(xì)胞進入腫瘤組織后開始上調(diào)這些 transcripts蝶锋，并逐漸獲得了 IL-1β+ TAM identity。
Fig 2d： 與此一致什往，外周血單核細(xì)胞的IL1B表達較低扳缕，招募進腫瘤組織后則顯著表達上調(diào)。
Fig 2e： 隨后作者使用了Ms4a3^cre-Rosa^TdT示蹤鼠别威，這種小鼠的粒細(xì)胞-單核細(xì)胞前體細(xì)胞也就是GMP和它們的后代都會被tdTomato標(biāo)記躯舔。結(jié)果顯示The vast majority of IL-1β⁺ TAMs 是 tdTomato⁺，提示這些細(xì)胞是循環(huán)單核細(xì)胞來源的省古，隨后浸潤進腫瘤并暴露在TME的微環(huán)境中粥庄。

4. PGE and TNF elicit IL-1β+ TAMs

作者觀察到在單核細(xì)胞向IL1B TAM分化過程中IL1B和TNF反應(yīng)的顯著富集，IL1B和TNF在患者PDAC組織中也顯著高表達豺妓。但是體外對BMDM細(xì)胞給予IL1B或TNF刺激并沒有誘導(dǎo)IL1B的表達惜互，這意味著IL-1β+巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變需要其他因子的協(xié)助。
Fig 2f： 此前有文獻報道PGE2在巨噬細(xì)胞中可以誘導(dǎo)IL1B的表達同時抑制干擾素的表達科侈，因此作者檢測了PDAC患者以及小鼠腫瘤組織中PGE2的表達载佳，顯示存在顯著高表達。而且PGE2-induced genes在IL1B TAM中顯著高表達（附件）臀栈。
Fig 2g： 因此作者探究了PGE2是否參與誘導(dǎo)IL1B TAM蔫慧。結(jié)果顯示單獨給予 PGE2 不能誘導(dǎo)IL1B的高表達，但是同時給予PGE2和TNF而不是PGE2和IL1B可以顯著誘導(dǎo)BMDM高表達IL1B权薯。

Fig 2h-j： RNAseq結(jié)果顯示PGE2和TNF協(xié)同誘導(dǎo)的BMDM姑躲，其高表達的program很多都與IL1B TAM類似，如誘導(dǎo) tumour-promoting inflammation 的基因 (Il1b 和 Il6) 同時抑制細(xì)胞毒性免疫 (Il10), 或刺激 prostaglandin 合成 (Ptges 和 Ptgs2), 髓系細(xì)胞招募 (Cxcl1, Cxcl2 和 Cxcl3) 和組織修復(fù) (Areg, Arg2, Wnt11 和 Il33)盟蚣。
Fig 2k： 對BMDM培養(yǎng)上清的多種蛋白的 elisa檢測得到了一致的結(jié)果黍析，PGE2和TNF協(xié)同誘導(dǎo)下，BMDM的IL-6 和 IL-10 表達增加屎开，而 CCL5, CXCL10, CXCL11 和 CXCL16 這些招募 cytotoxic T 和 NK 細(xì)胞的趨化因子表達則下降阐枣。
These data identify PGE2 and TNF as TME factors that are able to cooperatively elicit the IL-1β⁺ TAM state in PDAC.

Fig 2

5. IL-1β+ TAMs accumulate in hypoxic areas

Extended Data Fig. 5a-c： 原位PDAC的免疫熒光分析結(jié)果顯示 IL1β+ TAMs 優(yōu)先分布在腫瘤核心周圍富含成纖維細(xì)胞的基質(zhì)區(qū)域，并且在小鼠腫瘤和人PDAC中的早期時間點也可以檢測到這一分布特點。
Extended Data Fig. 5d-g： 所以作者對小鼠PDAC樣本進行了空間轉(zhuǎn)錄組測序蔼两。結(jié)果顯示IL-1β+TAMs與CD31+VEGFR2+內(nèi)皮細(xì)胞和缺氧區(qū)域接近甩鳄。因此推測出IL-1β+TAMs在PDAC的炎癥、血管生成和缺氧區(qū)域發(fā)生局部特異性分化额划，并與高PGE2和TNF協(xié)同活性相關(guān)妙啃。
Extended Data Fig. 5h-k： Spatial principal components (sPC) analyses discriminated spots enriched in IL-1β⁺, FOLR2⁺ or SPP1 TAMs⁺.
Extended Data Fig. 5l： Projection of signatures of genes synergized by PGE2 plus TNF showed broad overlap with spots enriched in IL-1β+ TAMs.
Extended Data Fig. 5m-n： IL-1β⁺ TAM regions were enriched in GO terms associated with inflammation, hypoxia, angiogenesis and wound healing.
Extended Data Fig. 5o-p： 免疫熒光也得到了一致的結(jié)果，顯示 the proximity of IL-1β⁺ TAMs to CD31⁺VEGFR2⁺ endothelial cells and hypoxic areas.
We conclude that IL-1β⁺ TAMs undergo local specification in inflamed, angiogenic and hypoxic regions of PDAC associated with high PGE2 and TNF synergistic activity.

Extended Data Fig. 5

6. PDAC-derived PGE promotes tumour growth

用COX2選擇性抑制劑塞來昔布處理免疫功能正常小鼠俊戳，降低了PDAC中PGE2的水平揖赴，減少了IL-1β+TAM和單核細(xì)胞的積累，增加細(xì)胞毒性GZMB+CD8+T細(xì)胞的浸潤抑胎，延緩腫瘤生長燥滑。
Fig 3a-b： 研究構(gòu)建了COX2基因敲除(KO)的PDAC細(xì)胞系，該細(xì)胞系不能產(chǎn)生PGE2阿逃，但在體外沒有表現(xiàn)出活性或增殖缺陷突倍。將COX2-KOPDAC細(xì)胞或球體移植到免疫功能正常的小鼠體內(nèi)，其生長受到CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞控制盆昙，并伴隨腫瘤引流淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的活化增加羽历。盡管中性粒細(xì)胞頻率減少，但兩組免疫細(xì)胞組成在疾病早期階段基本相似淡喜。
Fig 3c： 對COX2-KO腫瘤的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)也顯示IL-1β⁺ TAMs 表達關(guān)鍵特征基因和炎癥基因基因都下降秕磷，并具有干擾素反應(yīng)特征。這說明PDAC來源的PGE2在推動IL-1β+TAM狀態(tài)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用炼团，還表明靶向COX2以非干擾素依賴的方式推動TME重編程澎嚣，控制疾病進程。

7. Pathogenic IL-1β signalling in PDAC cells

Fig 3d-f： IL-1β 中和抗體 led to delayed PDAC growth, concomitant with reduced IL-1β expression by monocytes and TAMs and increased activation of cytotoxic T cells in draining lymph nodes.
Fig 3g： IL1R1-KO KPC cells showed a markedly reduced capacity to form tumours in immune-competent mice, concomitant with reduced infiltration of IL-1β⁺ monocytes and increased activation of CD8 T cells.
Fig 3h： Re-expression of IL1R1 in gene-targeted PDAC cells rescued tumour growth in vivo.
Fig 3i： Finally, stimulation with IL-1β promoted organoid generation by control PDAC cells, and not by IL1R1-KO PDAC cells, and explants of IL1R1-KO tumours showed defective organoid-forming efficiency.
These data highlight a requirement for tumour cell-intrinsic IL-1β signalling for PDAC growth.

8. Inflamed PDAC and TAMs engage in a loop

Extended Data Fig. 8a： RNAseq結(jié)果顯示IL1B干預(yù)的KPC細(xì)胞顯著上調(diào)了編碼髓系生長因子的基因Csf1和Csf2瘟芝，趨化因子Ccl2易桃，細(xì)胞因子Tnf和具有免疫調(diào)節(jié)功能的酶Ptgs2和Nos2。ELISA檢測也得到了一致的結(jié)果锌俱。
Extended Data Fig. 8b：為了評估這些分子的功能晤郑，作者對Ccr2^?/?鼠進行了 tumour challenge experiments，同時對WT鼠給予了 CSF-1的中和抗體治療贸宏。 兩個實驗都引起了腫瘤生長減慢造寝，提示單核來源的巨噬在PDAC中起到重要作用。
Extended Data Fig. 8c： IL1B干預(yù)的KPC細(xì)胞顯著富集到炎癥相關(guān)通路和Prostaglandin分泌通路吭练。與A圖中誘導(dǎo)TNF和PGE2表達相一致诫龙。
Extended Data Fig. 8d： 接著作者進行了supernatant transfer experiments，使用了IL1B鲫咽，在有和沒有COX2抑制劑的條件下培養(yǎng)KPC細(xì)胞签赃，隨后取出培養(yǎng)基谷异，并在培養(yǎng)基中加入TNF抑制劑和對照，來干預(yù)BMDM細(xì)胞锦聊。結(jié)果顯示TCM from untreated KPC cells 并沒有促進巨噬細(xì)胞表達 Il1b晰绎，this gene was induced in response to TCM of IL-1β-stimulated tumour cells。Inhibition of COX2 in KPC cells treated with IL-1β led to lower induction of Il1b in BMDMs exposed to the corresponding TCM, with this occurrence being even more evident upon neutralization of TNF.
這些數(shù)據(jù)表現(xiàn)了PDAC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的自我維持回路括丁，即隨著腫瘤細(xì)胞中IL-1β+信號釋放，單核細(xì)胞被招募到腫瘤中伶选，引發(fā)IL-1β+TAM狀態(tài)史飞。

Extended Data Fig. 8

9. Early inflammatory reprogramming of PDAC

整合用細(xì)胞因子處理的PDAC細(xì)胞和類器官的scRNA-seq數(shù)據(jù)，以定義腫瘤內(nèi)源性IL-1β+簽名基因(T1RS)仰税。T1RS在小鼠和人類PDAC轉(zhuǎn)錄組中富集构资，并與TCGA中IL-1β+TAMs豐度及TCGA中的低存活率相關(guān)。原位PDCA的縱向scRNA-seq分析顯示腫瘤細(xì)胞中T1RS在早期時間點上調(diào)陨簇，預(yù)示疾病呈指數(shù)型增長吐绵，并獲得增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑方案河绽。

對胰腺腫瘤發(fā)展模型小鼠的基因表達數(shù)據(jù)顯示己单，T1RS基因在小鼠良性胰腺上皮內(nèi)病變(PanIN)的細(xì)胞中表達最高，在已建立的PDAC和遠端轉(zhuǎn)移灶中維持較高水平耙饰。遺傳性或特發(fā)性慢性胰腺炎患者的巨噬細(xì)胞亞群也顯示出類似于IL-1β+TAMs的基因表達程序纹笼。對caerulein誘導(dǎo)的胰腺炎小鼠的正常或Kras突變細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)T1RS的表達顯著增加苟跪，且治療幾個月后仍有增高廷痘。因此可以推斷炎癥重編程和T1RS表達發(fā)生在腫瘤發(fā)生早期，會導(dǎo)致疾病進展和患者不良預(yù)后相關(guān)的持續(xù)轉(zhuǎn)錄變化件已。

Fig 4

9. IL-1β+ TAMs colocalize with T1RS+ PDAC

分析PDAC患者scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)有T1RS高水平表達的腫瘤細(xì)胞笋额。通過偽時間分析將T1RS+PDAC確定為一個由T1RS本身以及已知的IL-1β+靶基因(如NFKBIA、IL1RN和CXCL1)表達逐漸增加驅(qū)動的基因表達軌跡的終點篷扩。且T1RS+PDAC細(xì)胞的預(yù)測發(fā)展還與腫瘤標(biāo)志物的增加和胰腺腫瘤發(fā)生相關(guān)的GO術(shù)語有關(guān)兄猩，強調(diào)了炎癥重編程與腫瘤細(xì)胞獲得致病程序之間的內(nèi)在相關(guān)性。

利用人PDAC中的單細(xì)胞空間基因表達鑒定巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的局部相互作用鉴未，發(fā)現(xiàn)CXCL1與KRT19和標(biāo)記巨噬細(xì)胞(CD68)的基因厦滤，以及IL-1β+ (IL1B、IL1A和THBS1)和PGE2(PTGS2和PTGER1)存在明顯的空間共表達歼狼；與其他巨噬細(xì)胞亞群相比掏导，IL-1β+TAMs標(biāo)志性基因的相關(guān)性更高。配體-受體相互作用分析結(jié)果顯示了IL-1β+TAMs與T1RS+PDAC細(xì)胞之間的空間限制性交流羽峰，交流主要通過PGE2- IL-1β+通路維持趟咆。這一相互作用可能有助于解釋腫瘤細(xì)胞的炎性重編程和病理性程序的獲取添瓷。

Fig 5

結(jié)論

總的來說，本研究發(fā)現(xiàn)了PGE2- IL-1β+通路值纱，將其視為腫瘤炎癥進展的“驅(qū)動器”鳞贷。炎癥重編程和T1RS表達是胰腺腫瘤發(fā)生的早期事件，并導(dǎo)致與疾病進展和患者預(yù)后不良相關(guān)的持續(xù)轉(zhuǎn)錄變化虐唠。IL-1β+TAM和PDAC之間存在正反饋環(huán)路搀愧，因此可以通過阻斷PGE2或IL-1β+活性來打破該促癌環(huán)路，從而實現(xiàn)TAMs和胰腺癌細(xì)胞的重編程并拮抗腫瘤細(xì)胞內(nèi)外的炎癥疆偿，從而抑制胰腺癌的炎癥和生長咱筛，為重新調(diào)整免疫動態(tài)提供了新的靶點和策略。為胰腺癌的預(yù)防和治療提供了新思路杆故，促進胰腺癌治療的研究進展迅箩。

亮點：
1、研究將單細(xì)胞和空間基因組學(xué)與功能實驗相結(jié)合处铛，更好的揭示了胰腺癌中巨噬細(xì)胞的功能饲趋，解決了IL-1β+ TAMs的分子、空間和功能調(diào)控撤蟆，可以為針對IL-1β+或COX2作為預(yù)防性或聯(lián)合免疫療法的臨床試驗的設(shè)計和解釋提供信息奕塑。
2、研究發(fā)現(xiàn)了PGE2 - IL - 1β+通路家肯，通過阻斷PGE2或IL-1β+活性進行TAM重編程爵川，使胰腺癌免疫動力學(xué)重新編程的預(yù)防或治療策略成為可能。