前幾天的一篇Cell Mol Immunol涎嚼，IF：22.096

1. CD146 was expressed on a subset of macrophages in the tumor microenvironment

為了確定CD146在腫瘤中的表達(dá)情況炭菌，作者首先在人和小鼠腫瘤組織中檢測了TAM中CD146的表達(dá)箫章。
Fig 1A-B： 小鼠肝臟腫瘤中CD146和髓系marker CD11b共定位奸攻，流式結(jié)果顯示CD146在約40%的CD11b⁺F4/80⁺巨噬細(xì)胞表達(dá)扶供。
Fig 1C-D： 隨后作者在人的肝癌樣本中進(jìn)行了檢測裹虫。作者取了肝癌組織有滑，癌旁組織和正常組織晋南，檢測了CD146的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)CD68巨噬細(xì)胞在正常和癌旁組織中均勻分布蚣驼，在腫瘤組織中則主要around the stroma魄幕。表達(dá)CD146的巨噬細(xì)胞則主要存在于腫瘤組織和癌旁組織之間的tumor margins。
Fig 1E-G：流式結(jié)果也顯示CD146巨噬細(xì)胞在癌旁組織中最多颖杏。

2. CD146 expression on macrophages was controlled by STAT3 signaling in the tumor microenvironment

由于前面發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)CD147巨噬下降纯陨，作者想要去探究原因。
Fig 2A-C： 作者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在TCM刺激早期(24–48 h)上調(diào)留储，但是在更長時(shí)間的刺激下下調(diào)(72–96h)翼抠。此外，短期刺激時(shí)M1的marker如iNos, Tnfa, Il1b, Il6出現(xiàn)上調(diào)获讳，長期刺激M2的marker Arg1, Ym1, Il10, Mgl1則出現(xiàn)上調(diào)（附件）阴颖。
這個(gè)現(xiàn)象跟腫瘤內(nèi)CD147巨噬下降一致。

TCM是tumor cell-conditioned medium丐膝，是模擬腫瘤生長微環(huán)境的培養(yǎng)基

Fig 2D： 為了確定是什么信號通路調(diào)控者CD146的表達(dá)量愧，作者對TCM- stimulated 和 non–TCM-stimulated巨噬細(xì)胞進(jìn)行了蛋白組檢測，得到128個(gè)上調(diào)蛋白和82個(gè)下調(diào)蛋白尤误。（這個(gè)log2FC閾值卡的好寬松鞍时，看起來是0.25）
Fig 2E： 隨后作者做了轉(zhuǎn)錄因子富集分析肠仪，發(fā)現(xiàn)有25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控差異蛋白的表達(dá)苟弛。（這不是找到了25個(gè)砌溺，而是展示了top25吧）

這個(gè)圖是用ChIP-X Enrichment Analysis (ChEA3)做的

在作者團(tuán)隊(duì)此前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路促進(jìn) M2-like 極化尤勋，伴隨著CD146的下調(diào)喘落，因此作者主要關(guān)注了STAT3茵宪。

Fig 2F： TCM刺激20min后，巨噬細(xì)胞STAT3的磷酸化顯著上調(diào)瘦棋。
Fig 2G： 而且STAT3的活化隨著TCM刺激時(shí)間而增加稀火。
Fig 2H-I： 在使用了STAT3抑制劑之后，作者發(fā)現(xiàn)CD146的表達(dá)顯著上調(diào)赌朋。

TF knockdown analysis (http://www.licpathway.net/KnockTF/analysis) indicated that CD146 was negatively regulated by STAT3 (Fig. S1I).

3. CD146 expression on macrophages inhibited tumor development

Fig 3A： 為了明確CD146⁺巨噬在腫瘤生長中的作用凰狞，作者首先分析了CD146⁺巨噬細(xì)胞比例和HCC病人生存率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示CD146⁺巨噬細(xì)胞比例越高沛慢，患者存活期越長赡若。
Fig 3B： 隨后作者構(gòu)建了巨噬細(xì)胞CD146條件性敲除小鼠，構(gòu)建了肝癌和結(jié)直腸癌模型团甲。發(fā)現(xiàn)CD146敲除鼠的兩種腫瘤都生長的更快逾冬。
Fig 3C-E： 在diethylnitrosamine (DEN)誘導(dǎo)的原位肝細(xì)胞癌模型中，和對照相比躺苦，巨噬細(xì)胞CD146敲除鼠的腫瘤發(fā)生率和surface tumor都更多身腻。
Fig 3F-G： KO鼠腫瘤中的血管也更多，髓系細(xì)胞比例增加匹厘，T細(xì)胞比例相對減少嘀趟。此外DC和NK細(xì)胞比例也減少，CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCs和Treg增加集乔。
Fig 3H-J： 為了確定增加的CD146⁺巨噬細(xì)胞和antitumor activity之間的關(guān)系去件，作者使用對照和CD146的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW坡椒，和肝癌細(xì)胞（1:2）一起輸給小鼠扰路，發(fā)現(xiàn)輸入過表達(dá)質(zhì)粒的小鼠腫瘤體積顯著更小。

匪夷所思的操作增加了...哪怕用BMDM呢倔叼，也比直接回輸細(xì)胞系強(qiáng)啊

Fig 3K：作者還用了嵌合小鼠模型汗唱，將CD45.1⁺ (WT) donors的骨髓和CD146 M-WT (CD45.2⁺CD45.1^–， mixed WT-WT)或CD146 M-KO (CD45.2⁺CD45.1^–丈攒，mixed KO-WT)的骨髓1:1混合哩罪，移植給了CD45.1+ host mice or M-WT or M-KO host mice。6周后嵌合小鼠被用于構(gòu)建皮下移植腫瘤模型或原位肝腫瘤移植模型巡验。
Fig 3L-N： 和移植WT-WT小鼠相比际插，移植KO-WT骨髓的小鼠腫瘤更大。

4. The antitumor effect of CD146+ macrophages was partially dependent on T cells

巨噬細(xì)胞在腫瘤生長中的作用有很多決定因素显设，如調(diào)節(jié)腫瘤血管生成框弛、調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞或直接影響腫瘤細(xì)胞。
Fig 4A-D： WT和CD146KO的巨噬在吞噬能力上沒有差別
Fig 4E-F：在增殖能力上也沒有差別
These data suggested that CD146 was not directly involved in the function of macrophages in tumor phagocytosis or proliferation.

由于腫瘤細(xì)胞的eradication主要依賴于T細(xì)胞捕捂，作者隨后探究了巨噬 CD146介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長抑制是否是T細(xì)胞依賴的瑟枫。
Fig 4G-H：作者將CD146 WT 或 KO 巨噬和腫瘤細(xì)胞2:1混合斗搞，腹腔注射給了WT和Rag1 KO (T細(xì)胞缺陷鼠)。結(jié)果顯示注射KO細(xì)胞給WT鼠慷妙，其腫瘤大小比注射WT細(xì)胞給WT鼠顯著要大僻焚，但注射給Rag1 KO鼠其腫瘤大小則沒有明顯差異。

這些結(jié)果提示CD146巨噬介導(dǎo)的腫瘤大小抑制主要依賴于T細(xì)胞膝擂。

5. CD146 deletion on macrophages promoted the recruitment of CD11b+Gr-1+ MDSCs

由于M-KO存在抑制性腫瘤免疫微環(huán)境虑啤，而MDSC是重要的免疫抑制細(xì)胞，作者推測 M-KO 巨噬可能與MDSCs的招募有關(guān)架馋。
Fig 5A-C： 作者將Hepa1-6細(xì)胞和 M-WT 或 M-KO 鼠巨噬混合咐旧，腹腔注射給了enhanced green fluorescent protein (EGFP)-transgenic mice。同樣的绩蜻，注射M-KO 鼠巨噬的鼠腫瘤大小顯著要小铣墨。
Fig 5D-E： 隨后作者分離了腫瘤浸潤的EGFP⁺白細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)注射了M-KO 鼠巨噬的小鼠CD11b⁺ Gr-1⁺ MDSCs (approximately 50%) 顯著增多办绝，尤其是 Ly6G⁺ G-MDSCs伊约，而腫瘤浸潤C(jī)D4⁺和CD8⁺ T 細(xì)胞則顯著更低。
Fig 5F-H： 在另一個(gè)EL4腫瘤模型中也得到了一致的結(jié)論孕蝉。

Fig 5I： 為了確定CD146-KO巨噬細(xì)胞對MDSC的招募作用屡律，作者設(shè)計(jì)了體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。下層鋪的是M-WT或M-CD146 KO降淮，上層底下鋪了一層內(nèi)皮超埋，然后加了從EL4腫瘤鼠中分離的CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCs。
Fig 5J： 結(jié)果顯示CD146 KO的巨噬招募了更多的MDSC

這個(gè)實(shí)驗(yàn)倒是很好理解 但是這是怎么做的檢測呢佳鳖？把下室的細(xì)胞做熒光/消下來做流式霍殴？

Fig 5K-L： 為了探究是哪種細(xì)胞因子/趨化因子促進(jìn)了M-KO鼠中MDSC的招募，作者使用Luminex檢測了36個(gè)細(xì)胞因子/趨化因子系吩，又在mRNA水平做了檢測来庭，并檢測了TCM不同刺激時(shí)間的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)多種趨化因子表達(dá)增加穿挨。
Fig 5M： 抑制了CCR5后趨化下降

6. CD146-deleted macrophages promoted the recruitment of MDSCs via JNK signaling

Fig 6A： 為了探究CD146調(diào)控細(xì)胞因子上調(diào)的機(jī)制月弛，作者對M-KO macrophages和 M-WT macrophages進(jìn)行了蛋白組檢測，鑒定出26個(gè)上調(diào)蛋白和21個(gè)下調(diào)蛋白科盛。(都沒打過轉(zhuǎn)錄組帽衙，上來都是蛋白組，真有錢啊)
Fig 6B： 預(yù)測了調(diào)控這些蛋白的轉(zhuǎn)錄因子贞绵，發(fā)現(xiàn)JUN是其中最重要的TF厉萝，提示JNK信號通路可能在M-KO macrophages中起到比較重要的作用。
Fig 6C-D： 為了驗(yàn)證前面的假設(shè)，作者使用TCM刺激了M-KO macrophages和 M-WT macrophages冀泻，檢測了JNK信號通路的分子常侣。發(fā)現(xiàn)敲除CD146后，通路激活更強(qiáng)弹渔。提示CD146 negatively controlled JNK signaling in macrophages胳施。

為了確定M-KO macrophages促進(jìn)MDSC招募是通過JNK信號通路，作者檢測了給或不給JNK抑制劑時(shí)TCM刺激下M-WT 和 M-KO巨噬的趨化因子表達(dá)情況肢专。
Fig 6E-F： 發(fā)給給了抑制劑后趨化因子表達(dá)顯著下降舞肆。

7. CD146 positively regulated NLRP3 inflammasome activation by JNK signaling

We next explored how to enhance the antitumor activity of TAMs.
在Fig 6A中，上調(diào)的FC最大的蛋白是Tmem176b

Fig 7A： 分選normal, peritumor 和 intratumor 組織中CD11b⁺CD14⁺CD163⁺巨噬的轉(zhuǎn)錄組博杖，作者發(fā)現(xiàn)MCAM的在正常組織中表達(dá)高椿胯，在癌旁組織和腫瘤內(nèi)部表達(dá)低，TMEM176B則相反剃根。此前有報(bào)道提示myeloid TMEM176B是腫瘤免疫治療的potential modulator哩盲，因此作者推測TMEM176B受MCAM的負(fù)性調(diào)控，并調(diào)節(jié)腫瘤生長狈醉。
Fig 7B： 在TCM的刺激下廉油，M-KO 細(xì)胞或 CD146- KO Raw264.7細(xì)胞的TMEM176B表達(dá)顯著比對照要高。
Fig 7C：MCAM對TMEM176B的負(fù)性調(diào)控受JUN調(diào)控

此前有文獻(xiàn)報(bào)道TMEM176B參與移植Caspase-1的活化和IL-1β的成熟（Caspase-1和IL-1β都是inflammasome活化的標(biāo)志）苗傅，基于MCAM對TMEM176B的負(fù)性調(diào)控關(guān)系抒线，作者推測CD146參與炎癥小體的活化。
Fig 7D： 結(jié)果顯示TCM刺激24h后CD146-deleted macrophages Il1b的表達(dá)顯著比M-WT細(xì)胞要高渣慕。
Fig 7E： TCM刺激的M-WT和M-KO的western證實(shí)了CD146-deleted macrophages炎癥小體活化下降嘶炭。
Fig 7F-G： TMEM176B inhibito增加了M-KO鼠的Caspase-1 activation and IL-1β maturation。

8. CD146 deletion-induced MDSC recruitment partially depends on TMEM176B

Fig 8A： 為了確定CD146 巨噬細(xì)胞的抗腫瘤效果是依賴于TMEM176B還是趨化因子逊桦，或是兩者的共同作用眨猎，作者使用ELISA檢測了TMEM176B inhibition后的趨化因子水平。結(jié)果顯示TMEM176B inhibition降低了CCL2, -3, -4的表達(dá)卫袒，對CXCL2和CXCL5則沒有影響宵呛。
Fig 8B： TMEM176B inhibitor Bayk8644 partially blocked M-KO- induced MDSC transmigration in vitro
這些結(jié)果提示TMEM176參與調(diào)控M-KO macrophages中一些趨化因子的表達(dá)。

作者同樣檢測了趨化因子的表達(dá)是否影響TMEM176夕凝。
Fig 8C： 使用chemokine inhibitor bindarit 對M-KO macrophages中TMEM176的表達(dá)沒有影響。
這些結(jié)果提示巨噬細(xì)胞中的CD146 deletion 上調(diào)了TMEM176B 和一些趨化因子如 CXCL2 和 CXCL5的表達(dá)户秤，而 TMEM176B的表達(dá)本身也可以促進(jìn)一些趨化因子的表達(dá)上調(diào)如CCL2, CCL3 和 CCL4, 引起 MDSC 遷移增加码秉。

為了探究CD146巨噬在體內(nèi)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長是通過TMEM176B，作者在M-WT和M-KO鼠構(gòu)建了腫瘤模型鸡号，并使用了BayK8644治療转砖。
Fig 8D-E： 結(jié)果顯示在M-WT小鼠，BayK8644治療抑制了約35%的腫瘤生長，在M-KO鼠中抑制了約55%府蔗。
Fig 8F： 流式分析也提示BayK8644-treated M-KO mice存在更少的MDSCs腫瘤內(nèi)浸潤晋控，T細(xì)胞則輕度增高。
These data suggested that tumor promotion in M-KO mice at least partially depends on TMEM176B expression.

Overall, the downregulation of CD146 in TAMs promotes the activation of JNK signaling, thereby upregulating the expression of TMEM176B and MDSC recruitment-related chemokines, which in turn accelerate tumor development (Fig. 8G).

看完的感覺：工作量好大

查了一下 作者是專門研究CD146的

值得學(xué)習(xí)的點(diǎn)：

1. 蛋白組數(shù)據(jù)+轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測（ChEA3/KnockTF）
2. 體外給巨噬細(xì)胞過表達(dá)靶分子+回輸 （尤其適用于不好直接體外給藥阻斷的胞內(nèi)分子）
3. 看分子A/細(xì)胞A介導(dǎo)的效應(yīng)是否是另一種分子B/細(xì)胞B依賴的：給分子B/細(xì)胞B缺陷鼠過表達(dá)/回輸分子A/細(xì)胞A姓赤。
4. 看一種細(xì)胞對另一種細(xì)胞的趨化（Fig 5I-J）+ 趨化效應(yīng)是什么介導(dǎo)的（Fig 5K-M）