發(fā)現(xiàn)服務(wù)器上沒有安裝STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference)恬吕，這個轉(zhuǎn)錄組最常用的比對工具之一锚贱，也是我之前一直的用的轉(zhuǎn)錄組比對工具字柠，今天安裝一下并重新學(xué)習(xí)，好好理解之前設(shè)置的參數(shù)是否正確渠退。
STAR是ENCODE計劃(ENCyclopedia Of DNA Elements,人類基因組DNA元件百科全書計劃)的御用pipeline工具攘乒，在轉(zhuǎn)錄組的文章中出鏡率極高，別人說其準(zhǔn)確率高，映射速度快王暗，但需要占用大量內(nèi)存悔据，對計算資源有較高的要求。在之前Hisat2安裝使用過程中俗壹，提到了2017年的一篇NC比較轉(zhuǎn)錄組比對工具的文章科汗，又查了一下，這樣總結(jié)的：STAT相比較TopHat和Hisat2绷雏，有較高的唯一比對率肛捍；STAR會將沒有paired mapping上的reads都剔除，避免single reads比對到基因組上之众；并且STAR對lower-quality（包括more soft-clipped和錯配堿基）比對有較高的容忍度拙毫，這對一些雜合率較高的基因組優(yōu)勢比較明顯；這次注意到棺禾，在用GATK對RNA-Seq進(jìn)行 Call Variants時缀蹄，采用STAR的STAR 2-pass模式，估計以后也會用到膘婶。
下載安裝軟件
https://github.com/alexdobin/STAR
選擇其中一個版本下載后缺前， tar -zxvf 進(jìn)行解壓：
tar -zxvf STAR-2.7.9a.tar.gz
cd STAR/source
?make STAR
二、構(gòu)建基因組索引Index
和Hisat2一樣悬襟，需要先構(gòu)建基因組索引衅码，索引文件作用現(xiàn)在還只記得是在比對過程中，我們并不是把幾十萬條reads直接比對到基因組上去脊岳，而是和Index進(jìn)行比較逝段，使比對過程變地可行，希望等課題結(jié)束后割捅，再回過頭來好好學(xué)習(xí)一下索引文件作用的原理奶躯，先上腳本：
參數(shù)解釋：
--runThreadN：線程數(shù)為10
--runMode：genomeGenerate，構(gòu)建基因組索引亿驾；
--genomeDir：指定索引生成目錄嘹黔；
--genomeFastaFiles：指定參考基因組；
--sjdbGTFfile：指定參考基因組的注釋文件莫瞬；
--sjdbOverhang：這個是reads長度的最大值減1儡蔓，默認(rèn)是100，我不是很理解很多人分析的學(xué)習(xí)方法中都設(shè)置100疼邀，二代測序都是150bp的序列長度喂江，我設(shè)置了149 (有時間時改一下數(shù)值比較一下對結(jié)果是否有影響);
發(fā)現(xiàn)有三個反斜杠“\”異常成了黃色，暫時不清楚原因檩小，結(jié)果報錯了：
其實我也不知道為啥开呐，將運行命令行的反斜杠去掉，再試一下：
剛才的問題解決了，又報了其它錯誤信息：
居然是gtf文件的錯誤筐付，第一次遇見這個問題卵惦，然后找原因：
我們看一下gtf的開頭是CM023448.1，如下圖：
我的參考基因組開頭是>GWHAMMI00000001瓦戚，如下圖：
原來是染色體的命名方式不一樣沮尿，一個是CM開頭，另一個是GWHAMMI開頭较解，我回到NCBI去下載序列文件又看了一下,居然是我之前下錯文件了(從另一個數(shù)據(jù)庫下載的參考基因組畜疾，兩個數(shù)據(jù)庫同一物種染色體編號規(guī)則不同)，之前做的工作又浪費了印衔，重新下載啡捶，指定序列文件，30min后奸焙，成功建立索引瞎暑，索引目錄如下：
reads比對：
相比于Hisat2，STAR太多的參數(shù)設(shè)置了与帆，對于模式生物還好了赌，很多默認(rèn)參數(shù)就可以，但對于我的課題研究玄糟，就得仔細(xì)看看這些參數(shù)了勿她，著實用去了我不少時間，先上我的腳本阵翎，如下圖：
我的參數(shù)設(shè)置：
未用的其它參數(shù)：
--outFilterMismatchNmax：比對時允許的最大錯配數(shù)(可根據(jù)結(jié)果修改);
--outSAMmapqUnique60：將uniquelymapping reads的MAPQ值調(diào)整為60逢并，滿足下游使用GATK進(jìn)行分析的需要;
--readFilesCommand：對FASTQ文件進(jìn)行操作;
--readFilesIn：輸入FASTQ文件的路徑;
--outSJfilterReadsUnique：對于跨越剪切位點的reads（junction reads)，只考慮跨越唯一剪切位點的reads;
--alignIntronMin：最短的內(nèi)含子長度設(shè)定了20贮喧，(根據(jù)GTF文件計算);
--alignIntronMax：最長的內(nèi)含子長度設(shè)定了50000筒狠，(根據(jù)GTF文件計算);
--bamRemoveDuplicatesType?? 輸出BAM文件時，STAR還可以對BAM進(jìn)行一些預(yù)處理箱沦，用于去重。
四：結(jié)果如下圖雇庙，
1谓形、使用samtools查看生成的BAM文件。
samtoolsview sample_Aligned.sortedByCoord.out.bam |head -n 5
2疆前、結(jié)果內(nèi)容：
Aligned.sortedByCoord.out.bam:reads比對到基因組的位置;
Aligned.toTranscriptome.out.bam:reads比對到轉(zhuǎn)錄本的位置寒跳；
Log.final.out：統(tǒng)計了比對情況的信息,是非常重要的結(jié)果;
SJ.out.tab:splice junctions的一些信息，其中需要注意的是：對于junction的位置信息竹椒，STAR則是按照intron的起始和終止位置來定童太，而其他的一些軟件則是按照exon的位置來決定的
附：我比較了一下star和Hisat2的結(jié)果差異，在運行時間和比對率上，star并沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性上书释。
參考：
https://blog.csdn.net/weixin_28913137/article/details/112281831
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