BUSCO - 組裝質量評估軟件

BUSCO - Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs 直譯的話就是普遍通用的單拷貝直系同源測試
BUSCO通過同源基因數據庫從基因完整度來評價基因組組裝結果仅胞。BUSCO首先構建了不同物種的最小基因集，然后使用HMMER饮怯，BLAST,Augustus等工具分析組裝結果中的同源基因猬错，從而定量評估組裝是否完整。

文獻

《BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs》

說明

BUSCO是一款使用python語言編寫的對轉錄組和基因組組裝質量進行評估的軟件刹泄。在相近的物種之間總有一些保守的序列浦夷，而BUSCO就是使用這些保守序列與組裝的結果進行比對，鑒定組裝的結果是否包含這些序列喊暖，包含單條惫企、多條還是部分或者不包含等等情況來給出結果。

BUSCO 軟件根據OrthoDB 數據庫陵叽，構建了幾個大的進化分支的單拷貝基因集狞尔。將轉錄本拼接結果與該基因集進行比較，根據比對上的比例巩掺、完整性偏序，來評價拼接結果的準確性和完整性。

BUSCO使用其他的工具搭建了流程胖替，它的流程是

genoem assemble : tBLASTn --> Augustus --> HMMER3
Transcriptome   :             Find ORF --> HMMER3
Gene set        :                          HMMER3

1. 下載與安裝【方便】

這里使用conda來自動安裝BUSCO以及它的依賴工具研儒。如果沒有conda豫缨，那么可以查看這篇文章安裝conda。

安裝conda之后進行busco的安裝端朵。安裝完畢之后好芭，下載好數據庫文件就可以直接跳到運行那一步了。下面的配置啊冲呢，安裝之類的是針對【麻煩】的安裝方式舍败。

conda install busco

有時候在默認搜索庫中沒有找到相關信息，那么就嘗試下面的方法

# 構建conda的python3環(huán)境
conda create --name python36 python=3.6
#  然后激活
conda activate python36
# 執(zhí)行安裝
conda install -c https://conda.anaconda.org/bioconda busco
# 在使用完busco之后可以退出python36環(huán)境
conda deactivate

如果使用conda安裝成功敬拓，那么就執(zhí)行2\. 下載數據庫文件 -> 5\. 運行 -> 6\. 結果解讀 -> 7\. 畫圖

使用conda自動完整安裝過程邻薯，但是有時候沒有管理員權限或者其他一些原因無法這樣安裝，那么就可以根據下面的方法進行安裝乘凸。

1. 下載與安裝【麻煩】

不使用conda安裝的話厕诡，那么每一個工具需要單獨下載，然后導入到環(huán)境變量當中去营勤，讓busco想用到它們的時候能夠找得到它們灵嫌。在對這種關聯(lián)軟件安裝折磨之后對程序的安裝的理解有幫助的，加油冀偶！

依賴的工具

• Augustus
• HMMER
• Blast+

下載

• 下載軟件包

#  ============ 下載BUSCO  ============ 
cd ~/Applications/download
wget -c https://gitlab.com/ezlab/busco/-/archive/master/busco-master.zip -O busco.zip

# ============ 下載依賴的工具 ============
# 下載Augustus
wget -c http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/binaries/augustus.current.tar.gz
# 下載HMMER
wget -c http://eddylab.org/software/hmmer/hmmer.tar.gz -O hmmer.tar.gz
# 下載Blast+
wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST/ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz

安裝

cd ~/Applications/download

# === 安裝busco ===
unzip busco.zip
# 改名
mv busco-master busco 
# 移動到外部
mv busco ../
cd ../busco
# 安裝
python setup.py install

cd ~/Applications/download
# === 安裝Augustus ===
tar -xzvf augustus.current.tar.gz
cd augustus-3.3.1
cd ../
mv augustus-3.3.1 ../
cd ../augustus-3.3.1
# 打開common.mk文件，將ZIPINPUT = true注釋掉（即在最前面加一#號）
vim common.mk
# 安裝
make

cd ~/Applications/download
# === 安裝HMMER ===
tar -xzvf hmmer.tar.gz
cd hmmer-3.2.1
./configure
make

# === 安裝blast+ ===
tar -xzvf ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz
# 改名
mv ncbi-blast-2.7.1+ ../blast+-2.7.1-linux

# 刪除安裝包
cd ~/Applications/download
rm busco.zip
rm augustus.current.tar.gz
rm hmmer.tar.gz
rm ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz

2. 下載數據庫文件

上面軟件安裝完畢之后渔嚷，就開始下載數據庫文件了进鸠，根據組裝的物種來選擇對應的數據庫文件。

# 瀏覽器打開下列網址
https://busco.ezlab.org/

查找下載需要評估的組裝的物種對應的類群（最近：最近發(fā)現(xiàn)了busco的庫更新了形病，里面的數據庫的分類更加詳細了客年，但是大類還是下面5個，具體的詳細類別這里就不列舉了）

- Bacteria 細菌
- Protists 原生生物
- Metazoa 后生動物
- Fungi 真菌
- Plant 植物

例如下載植物的BUSCO的數據庫（對著需要下載的類群的圖片右鍵->復制鏈接地址漠吻，之后就得到了下載鏈接量瓜，然后在命令行使用wget之類的下載命令下載），比如下面我下載的是植物相關的途乃，我就下載的植物類群绍傲。

mkdir -p ~/database/BUSCO/
cd ~/database/BUSCO/
# 下載
wget -c https://busco.ezlab.org/datasets/embryophyta_odb9.tar.gz
# 解壓文件
tar -xzvf embryophyta_odb9.tar.gz

下面在執(zhí)行那一步對應的數據庫的文件路徑就是

~/database/BUSCO/embryophyta_odb9

3. 配置

這里配置是必須的，這一步需要仔細一些耍共，路徑出錯的話是無法通過busco的檢測的烫饼，在安裝好軟件之后 ~/Applications/busco/config/之中并沒有config.ini文件，只有一個config.ini_default文件试读，可以把里面的內容復制下來杠纵，

• 方法1

新建一個config.ini文件或者直接復制一份

cp config.ini_default config.ini

• 方法2

也可以按照下面的說明進行

# 增加配置文件
vim ~/Applications/busco/config/config.ini

加入如下內容

# BUSCO specific configuration
# It overrides default values in code and dataset cfg, and is overridden by arguments in command line
# Uncomment lines when appropriate
[busco]
# Input file
;in = ./sample_data/target.fa
# Run name, used in output files and folder
;out = SAMPLE
# Where to store the output directory
# out_path = /workdir
# Path to the BUSCO dataset
;lineage_path = ./sample_data/example
# Which mode to run (genome / protein / transcriptome)
;mode = genome
# How many threads to use for multithreaded steps
;cpu = 1
# Domain for augustus retraining, eukaryota or prokaryota
# Do not change this unless you know exactly why !!!
;domain = eukaryota
# Force rewrite if files already exist (True/False)
;force = False
# Restart mode (True/False)
;restart = False
# Blast e-value
;evalue = 1e-3
# Species to use with augustus, for old datasets only
;species = fly
# Augustus extra parameters
# Use single quotes, like this: '--param1=1 --param2=2'
;augustus_parameters = ''
# Tmp folder
;tmp_path = ./tmp/
# How many candidate regions (contigs, scaffolds) to consider for each BUSCO
;limit = 3
# Augustus long mode for retraining (True/False)
;long = False
# Quiet mode (True/False)
;quiet = False
# Debug logs (True/False), it needs Quiet to be False
debug = True
# tar gzip output files (True/False)
;gzip = False
# Force single core for the tblastn step
;blast_single_core = True

[tblastn]
# path to tblastn
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin

[makeblastdb]
# path to makeblastdb
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin

[augustus]
# path to augustus
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin

[etraining]
# path to augustus etraining
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin

# path to augustus perl scripts, redeclare it for each new script        
[gff2gbSmallDNA.pl]                                                      
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         
[new_species.pl]                                                         
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         
[optimize_augustus.pl]                                                   
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         

[hmmsearch]                                                              
# path to HMMsearch executable                                           
path = ~/Applications/hmmer-3.2.1/src                                

[Rscript]                                                                
# path to Rscript, if you wish to use the plot tool                      
path = /usr/bin/

在新建好config.ini文件之后，

1. 將config.ini文件中的out_path = /workdir前面加上#
   因為這個工具的輸出路徑有時候會出錯钩骇，所以干脆將它注釋掉比藻，之后假如運行busco之后铝量，輸出的路徑就是你之前cd到的路徑

2. 之后一般需要改這幾項對應的路徑（里面的路徑需要更改為你自己的工具的路徑）

??這些就是剛才我們安裝的blast+和HMMER和Augustus的執(zhí)行文件的路徑，只需要把前面的路徑改為你安裝的程序的位置的路徑就可以啦银亲！

比如我的blast+是安裝在~/Applications之下慢叨， 執(zhí)行文件在~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin 之中，比如你是安裝在~/NAME/biosofts下面群凶，那么對應的執(zhí)行文件的路徑就是~/NAME/biosofts/blast+-2.7.1-linux/bin插爹。

其實可以看到上面的都是一些路徑或者默認選項設置，讀取配置文件然后設置這些項目進入程序是很多工具的方式请梢。

4. 導入環(huán)境變量

這里沒有對軟件進行完整的安裝赠尾，所以需要導入臨時環(huán)境變量（防止在配置文件中busco沒有找到相關程序）
下面的路徑都是剛才安裝的程序的對應的路徑

# augustus工具的執(zhí)行文件所在文件夾
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/bin:$PATH"
# augustus工具附加腳本所在文件夾
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/scripts:$PATH"
# augustus工具配置文件的所在位置 。AUGUSTUS_CONFIG_PATH 需要使用絕對路徑
export AUGUSTUS_CONFIG_PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/config"
# hmmer工具的執(zhí)行文件所在文件夾
export PATH="/home/ssd/Applications/hmmer-3.2.1/src:$PATH"
# blast+工具的執(zhí)行文件所在文件夾
export PATH="/home/ssd/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin:$PATH"

[可選]如果經常使用毅弧，建議加入永久的環(huán)境變量

# 打開.bash_profile文件
vim ~/.bash_profile

# 在末尾添加上面的導入環(huán)境變量的內容

5. 運行

開始評估

基本的使用方法為

run_BUSCO.py -i [組裝的文件.fasta]  -l  [數據庫文件夾] -o [輸出文件名] -m [評估模式] [其他一些選項]

??實際使用例子气嫁，如果是使用conda安裝的BUSCO的話搭综。執(zhí)行的時候不需要寫完整的路徑灾票，只需要寫run_BUSCO.py。

# 首先cd到對應的組裝文件的文件夾
# 

# -i 輸入文件
# -l BUSCO的數據庫文件
# -o 輸出的文件名的后綴以及文件夾的名稱
# -m 分析類型（genome术幔、transcriptome元咙、proteins）
# --cpu 線程數
~/Applications/busco/scripts/run_BUSCO.py \
    -i contigs.fasta \
    -l ~/database/BUSCO/embryophyta_odb9 \
    -o suffix\
    -m genome \
    --cpu 8

??注意：在fasta文件中梯影，一些組裝工具生成的contig的名字是這種形式的>contig/1/12345之類的，這種fasta文件在運行的時候BUSCO會報錯庶香，解決辦法就是將這種改名甲棍，老辦法，perl單行程序赶掖。

cat contig.fasta | perl -p -e 's{/}{}g' > contig.new.fasta

6. 結果解讀

在運行文件夾下會有

• run_suffix 文件夾：因為上面-o選項設置了suffix感猛，所以文件夾名稱加上了后綴。在這個文件夾里面奢赂，有一個文件最為重要陪白。就是short_summary_suffix.txt；

下面是個范例

# Summarized benchmarking in BUSCO notation for file assembly/spades/contigs.fasta
# BUSCO was run in mode: genome
    C:98.6%[S:98.6%,D:0.0%],F:0.0%,M:1.4%,n:148

    146 Complete BUSCOs (C)
    146 Complete and single-copy BUSCOs (S)
    0   Complete and duplicated BUSCOs (D)
    0   Fragmented BUSCOs (F)
    2   Missing BUSCOs (M)
    148 Total BUSCO groups searched

C值表示和BUSCO集相比的完整度，M值表示可能缺少的基因數聋迎，D則是重復數脂矫。

一般來看，S似乎越大越好霉晕，M越小越好庭再，說明組裝的越完整捞奕，因為檢測的單拷貝同源基因出現(xiàn)得多。但是D與F這兩個數值越大不見得就是好的拄轻，因為組裝的錯誤可能會帶來這兩個值的增大颅围。

BUSCO評估結果：
一般情況下對于完整度較好的基因組組裝結果來講，Complete and single-copy越多越好恨搓，而Complete and duplicated和Missing越少越好院促，對于Fragmented也盡可能地少一些。

真實項目中斧抱，Complete BUSCOs (C) 的比例通常都能達到 80% 以上常拓。

下面列舉了三種比對的情況。

• 情況1 - 完全覆蓋

說明: +表示組裝得到基因序列 -表示用于測試的基因序列

組裝 : ================+++++++==============
測試                   -------
                       或者
組裝 : ==============+++++++++++============
測試                   -------               

• 情況2 - 部分覆蓋

組裝 : ================+++++++==============
測試                   -----
                     /      \
                       或者
組裝 : ================+++++++==============
測試                   -------
                     /        \

• 情況3 - 沒有比對

組裝 : ================+++++++==============
測試 

一般來看S + D的數值也就是C的值越大越好辉浦，但是在文獻中作者說如果D的數值太多的話可能意味著組裝錯誤的可能性較大弄抬。因為一個基因（BUSCO數據庫中該基因一般為單拷貝）被覆蓋多次，那么可能就是說該基因所在的片段組裝可能出現(xiàn)問題宪郊。
因為理論上

理論上：--------------------------------------------
實際上：--------   ----------    ----------    -----
錯誤的：--------                 -------------
           \\\\                    ///
          -----------     --------------

理論上組裝之后各個片段之間應該前后有序掂恕，之間除了重復區(qū)域或者其他特殊片段之外不應該有可以重疊的地方。
例如

sequence1 : ..TAGTCGTGA                         GTGCATGCTGTAGC..
                       \                       /
                        AAAATTGG......CGATGAAAA
                       /                       \
sequence2 : ..GGGTAGCGG                         TTGACTAGCTAGCT..

也就是說中間一段序列是兩個序列的共同部分弛槐，除非這個序列存在多個拷貝懊亡，否則就很可能是拼接錯誤。通常一般這種拼接錯誤的序列的兩端會出現(xiàn)重復序列乎串。另外如果是多倍體組裝的話店枣，D值也可能大。

基因組組裝結果不能僅僅只是通過這一個軟件來判定灌闺。比如還可以借助QUAST和常規(guī)指標N50艰争、總的核酸量坏瞄、點陣圖等等多個輔助標準來進行綜合的評估桂对。

7. 畫圖

在執(zhí)行完畢之后，可以使用generate_plot.py畫圖鸠匀，這個圖形說白了就是一種條形圖蕉斜。

• 首先把所有的經過BUSCO檢測的結果聚集到一個文件夾之內

mkdir my_summaries
cp run_SPEC1/short_summary_SPEC1.txt my_summaries/.
cp run_SPEC2/short_summary_SPEC2.txt my_summaries/.
cp run_SPEC3/short_summary_SPEC3.txt my_summaries/.
cp run_SPEC4/short_summary_SPEC4.txt my_summaries/.
cp run_SPEC5/short_summary_SPEC5.txt my_summaries/.

• 然后運行

python scripts/generate_plot.py –wd my_summaries

image

這個圖就是將剛才第6步中的那五個數值變成這種條形圖顯示，讓這種多少的對比更加明顯缀棍，當然了宅此，你自己也可以使用正則表達式將數值抓取出來，之后輸出到文件中爬范，然后使用python或者R來畫圖也是可以的父腕。

參考

• 基因課-使用BUSCO評價轉錄本拼接的質量
• 「干貨集市」使用BUSCO評估基因組組裝完整性
• Augustus安裝
• hmmer的安裝與使用
• Blast+安裝和簡單使用
• BUSCO手冊
• Installing Augustus with manual bamtools installation
• Augustus install mac
• Installing Augustus with manual bamtools installation

Augustus安裝錯誤

這種問題在Mac上安裝出現(xiàn)的可能性比較大
y

cd auxprogs && make
make[1]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
cd bam2hints; make;
make[2]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
g++ -Wall -O2    -c bam2hints.cc -o bam2hints.o -I/usr/include/bamtools 
bam2hints.cc:16:27: fatal error: api/BamReader.h: No such file or directory
 #include <api/BamReader.h>
                           ^
compilation terminated.
Makefile:29: recipe for target 'bam2hints.o' failed
make[2]: *** [bam2hints.o] Error 1
make[2]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make[1]: *** [all] Error 2
make[1]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make: *** [all] Error 2

解決方法

第一步：安裝好bamtools

• 簡單的安裝方法

brew install bamtools libbamtools-dev

• 其他安裝方法

git clone git://github.com/pezmaster31/bamtools.git
mkdir build
cd build
cmake -DCMAKE_INSTALL_PREFIX=/your/path/to/bamtools ..
make
make install

第二步：修改路徑

• bam2hints Makefile

# 先進入到augustus的解壓目錄
cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints
vim Makefile

# ====== 修改下列值 =====

# 原始
INCLUDES = /usr/include/bamtools
# 修改
INCLUDES = $(BAMTOOLS)/include/bamtools

# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz

• filterBam Makefile

cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/filterBam/src/
vim Makefile

# ====== 修改下列值 =====

# 原始
BAMTOOLS = /usr/include/bamtools
# 修改
# BAMTOOLS = /usr/include/bamtools

# 原始
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS) -Iheaders -I./bamtools
# 修改
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS)/include/bamtools -Iheaders -I./bamtools

# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz

安裝

make BAMTOOLS=$(which bamtools)

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------I`m a line ! Thanks !---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

參考鏈接：http://www.reibang.com/p/5041460f7a5d