盡管RT-PCR檢測(cè)病毒RNA技術(shù)侧馅，已經(jīng)成為大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)對(duì)新冠患者排查的常規(guī)手段，也是COVID-19病例診斷的金標(biāo)準(zhǔn)食棕，但仍然需要血清學(xué)方法來(lái)表征SARS-CoV-2的體液反應(yīng)朗和。血清學(xué)檢測(cè)可以用來(lái)追蹤已經(jīng)清除感染的個(gè)體（尤其是輕度或無(wú)癥狀個(gè)體）的傳播，有助于了解病毒的流行病學(xué)簿晓，并將新冠免疫人員布置在醫(yī)院的關(guān)鍵前線(xiàn)位置眶拉。同時(shí)，評(píng)估新型疫苗臨床研究效果也必須通過(guò)血清學(xué)方法驗(yàn)證憔儿。SARS-CoV-2是有包膜的單鏈RNA病毒忆植，包含四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：膜（M），包膜（E）谒臼，刺突（S）和核衣殼（N）朝刊，其中N和S蛋白是最具免疫原性的病毒抗原，而只有S特異性抗體才能介導(dǎo)病毒中和蜈缤。因此拾氓，針對(duì)S蛋白的特異性抗體反應(yīng)是血清學(xué)檢測(cè)的首選參數(shù)。在這里劫樟，小編分享兩種無(wú)需使用中和抗體檢測(cè)商業(yè)試劑盒或產(chǎn)品也能檢測(cè)新冠抗體中和能力測(cè)定的方法痪枫。
1、抑制細(xì)胞融合測(cè)定法
穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)β-半乳糖苷酶的α亞基的293T細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)SAR-COV-S蛋白基因叠艳，穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)編碼β-半乳糖苷酶的ω亞基的293T細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)人ACE2基因奶陈，轉(zhuǎn)染后2天，將表達(dá)S蛋白的細(xì)胞和表達(dá)ACE-2的細(xì)胞以1：1的比例混合附较，同時(shí)加入待測(cè)試的抗體樣本吃粒，并在37℃下孵育3小時(shí)后，-80℃凍融裂解細(xì)胞拒课，用化學(xué)定量法檢測(cè)β半乳糖苷酶活性徐勃。（圖1）
如圖2所示事示，將表達(dá)S蛋白的細(xì)胞與不同的Ig抗體一起孵育，并與表達(dá)ACE2的細(xì)胞混合后僻肖，測(cè)定報(bào)告基因β-gal的活性作為細(xì)胞融合的指標(biāo)肖爵。用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的最佳擬合曲線(xiàn)計(jì)算IC?50值。其中ACE2-Ig有效抑制SARS-CoV-2 S蛋白介導(dǎo)融合臀脏，IC 50值為0.65μg·ml -1劝堪。mACE2-Ig對(duì)SARS-CoV-2的IC 50值0.48μg·ml -1。對(duì)照TIGIT-Fc在該測(cè)定中未顯示任何抑制作用揉稚。表明ACE2-Ig和mACE2-Ig均表現(xiàn)出對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白的有效中和活性秒啦。
同理，今年清華大學(xué)報(bào)道搀玖，用雙熒光素酶作為報(bào)告基因的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)余境，測(cè)試了兩種單克隆抗體對(duì)登革熱病毒感染的抗細(xì)胞融合活性（圖3）。證明無(wú)需β半乳糖苷酶試劑灌诅，雙熒光素酶也可以作為細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的報(bào)告基因芳来。
2、流式檢測(cè)法
只需要準(zhǔn)備表達(dá)病毒抗原的工具細(xì)胞株延塑、檢測(cè)IgG或IgM的流式二抗绣张、中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品或抗原配體的標(biāo)準(zhǔn)品即可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)答渔。而且流式可以圈出目標(biāo)細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)定量分析关带，因此比間接法的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)更靈敏。經(jīng)PCR確診的SARS-CoV-2感染患者標(biāo)本中沼撕，與市售的化學(xué)發(fā)光免疫分析CLIA和ELISA檢測(cè)試劑相比宋雏，對(duì)201 COVID-19血清的分析靈敏度最高。
pCG1_CoV_2019-S質(zhì)粒：編碼密碼子優(yōu)化的SARS-CoV-2 S重組蛋白序列（帶有跨膜區(qū)）务豺；pcDNA3.1質(zhì)粒用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照磨总。藍(lán)色熒光蛋白（BFP）和紅色熒光蛋白編碼質(zhì)粒（dsRed）用作轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的標(biāo)記蛋白；293細(xì)胞用CoV-S和熒光蛋白（BFP）瞬轉(zhuǎn)后作為工具細(xì)胞笼沥，將pcDNA3.1和15μg熒光蛋白（dsRed）瞬轉(zhuǎn)后作為內(nèi)部對(duì)照細(xì)胞蚪燕。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞奔浅，以1-ml等分樣的形式讓細(xì)胞在? 80°C下保存馆纳。檢測(cè)前，將等分試樣的細(xì)胞解凍汹桦，重懸于FACS緩沖液中鲁驶。將每個(gè)樣品（S蛋白工具細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞）中的每個(gè)樣品的0.5×10^5個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品的梯度稀釋液舞骆，4°C孵育30 min钥弯。用流式緩沖液洗滌兩次径荔，加入流式二抗染色（30分鐘，4°C脆霎，抗IgG-AF647总处；抗IgM-BV711）。PBS洗滌兩次睛蛛，然后重懸于流式緩沖液中以進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析辨泳。
將表達(dá)SARS-CoV-2S蛋白的293T細(xì)胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（模擬物）與COVID-19患者血清（S1-S3）或陰性對(duì)照血清（S4–S6）一起孵育）。左圖顯示了將共轉(zhuǎn)染的熒光蛋白作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記（BFP和dsRed）的細(xì)胞群的畫(huà)門(mén)玖院。右邊的直方圖分別描繪了兩個(gè)細(xì)胞群在每個(gè)樣品中的IgM和IgG熒光信號(hào)菠红。
（A）用ACE-2-Fc標(biāo)準(zhǔn)品做流式檢測(cè)，用來(lái)確定標(biāo)準(zhǔn)血清的ACE2濃度难菌。
（B）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血清试溯。曲線(xiàn)擬合生成用于未知樣品絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
（C）EuroImmun ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血清郊酒。曲線(xiàn)擬合生成用于未知樣品絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)遇绞。
（D）通過(guò)ELISA和SARS-CoV-2特異性IgG的細(xì)胞流式檢測(cè)，對(duì)7份COVID-19患者血樣的新冠抗體進(jìn)行定量燎窘。
總結(jié)一下摹闽，抑制細(xì)胞融合法需要準(zhǔn)備編碼抗原和配體的2種工具細(xì)胞株、中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品和β半乳糖苷酶試劑盒褐健。流式法只需要準(zhǔn)備表達(dá)病毒抗原的1種工具細(xì)胞株付鹿、檢測(cè)IgG或IgM的流式二抗、中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品即可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)蚜迅，而且流式可以圈出目標(biāo)細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)定量分析舵匾，因此比抑制細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的精確度更高。
