chip-seq Day 2 小鼠參考基因組文件的bowtie2的index制作

$ mkdir ref #新建reference文件夾
xingkx 17:41:23 ~
$ cd ref
xingkx 17:41:31 ~/ref
$ mkdir mm9
xingkx 17:41:48 ~/ref
$ cd mm9
xingkx 17:41:54 ~/ref/mm9
$  wget --timestamping \
        'ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/chromosomes/*'
--2023-04-03 17:41:57--  ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/chromosomes/*
           => ‘.listing’
Resolving hgdownload.cse.ucsc.edu (hgdownload.cse.ucsc.edu)... 128.114.119.163
Connecting to hgdownload.cse.ucsc.edu (hgdownload.cse.ucsc.edu)|128.114.119.163|:21... ^C
xingkx 17:42:26 ~/ref/mm9

試圖通過(guò)網(wǎng)頁(yè)鏈接下載小鼠mm9參考基因組失敗臂容，于是手動(dòng)下載肮街。

image.png

不要random文件逸绎，要下載md5文件

$ cd ..
xingkx 17:46:30 ~/ref
$ vim md5.txt
xingkx 17:49:04 ~/ref
$ cat md5.txt  #查看md5文件赃蛛，包含了要檢測(cè)的文件
79d6d3a0198d6dccaa6c2af23ec9be00  chr1.fa.gz
24893d2118e606d341f3a91836f6267d  chr10.fa.gz
f01fd408af17f393720044a44b3c4ee0  chr11.fa.gz
d882d9ba5696b6e6fdd80179670bc463  chr12.fa.gz
d400282edeb4c0529d5196019372d3c1  chr13.fa.gz
e4735f6e161a9498c2487958a6153891  chr13_random.fa.gz
1797fcbad80d0794b598d6fb6053e299  chr14.fa.gz
f182f5e0e3e5f90b3775b6e32274319b  chr15.fa.gz
ef9806225139e113257e0e20717e2285  chr16.fa.gz
46cc30a95e412eb0320255335a42863f  chr16_random.fa.gz
57e5044feac506810ed03d5bab6bb231  chr17.fa.gz
e16f391324164d5499fc48c05ef529e8  chr17_random.fa.gz
d409da85d239f0d8b1bfaa3a494be121  chr18.fa.gz
94ad4a7ceb60ad29feadb3d8aa2a925a  chr19.fa.gz
c06a6759bd5f7a14c7fe4aa0a6423e7e  chr1_random.fa.gz
14eaca978b51529479b5497634bf90ce  chr2.fa.gz
180b4b2179fd550a39d1cd0b841e4834  chr3.fa.gz
ddd635cdcebd2c6666b4dadbf1c52fd2  chr3_random.fa.gz
c86d544389b3c77b54070d8d041fbc19  chr4.fa.gz
de2a1bb1505fd53cf2b9849d3a16358d  chr4_random.fa.gz
d0d1e3c1a3914c1d2ec807330ee4d474  chr5.fa.gz
2e6a7618b193c877b9534101136bde47  chr5_random.fa.gz
4276c21b867322940abfccfd98e9c864  chr6.fa.gz
6e609fe100868e5b3051b9801b9efcf8  chr7.fa.gz
1f74d499fd66fbc3d2b239b4076e2177  chr7_random.fa.gz
e9b1b3ce3a1ce0a540bfb7eb2af44f59  chr8.fa.gz
0fad939822aab8a83fd9ef155bd0b52a  chr8_random.fa.gz
0b2c504c618a5dd04619bd82171cc6dd  chr9.fa.gz
4e30bb88d367d149a0aa050cc4e423cd  chr9_random.fa.gz
ea02ff9a4831504423d63f26a329b74e  chrM.fa.gz
e56577087f9765e2ecdf9d605ad2f3b8  chrUn_random.fa.gz
28b4c65ff0bf555bdf305d9b629794b4  chrX.fa.gz
a3c21a22e22d8fb4af962195e8b81e22  chrX_random.fa.gz
39079a4b2762f2237eca347d52c11215  chrY.fa.gz
5e013cab47168d75e96bdfc123771d54  chrY_random.fa.gz
xingkx 17:50:58 ~/ref
$ mv md5.txt mm9
xingkx 17:57:28 ~/ref
$ ls
mm9
xingkx 17:57:35 ~/ref
$ cd mm9
xingkx 17:58:03 ~/ref/mm9
$ ls
chr10.fa.gz  chr14.fa.gz  chr18.fa.gz  chr3.fa.gz  chr7.fa.gz  chrX.fa.gz
chr11.fa.gz  chr15.fa.gz  chr19.fa.gz  chr4.fa.gz  chr8.fa.gz  chrY.fa.gz
chr12.fa.gz  chr16.fa.gz  chr1.fa.gz   chr5.fa.gz  chr9.fa.gz  md5.txt
chr13.fa.gz  chr17.fa.gz  chr2.fa.gz   chr6.fa.gz  chrM.fa.gz
xingkx 17:59:56 ~/ref/mm9
$ md5sum -c md5.txt  #檢測(cè)下載數(shù)據(jù)的md5值
chr1.fa.gz: OK
chr10.fa.gz: OK
chr11.fa.gz: OK
chr12.fa.gz: OK
chr13.fa.gz: OK
md5sum: chr13_random.fa.gz: No such file or directory
chr13_random.fa.gz: FAILED open or read
chr14.fa.gz: OK
chr15.fa.gz: OK
chr16.fa.gz: OK
md5sum: chr16_random.fa.gz: No such file or directory
chr16_random.fa.gz: FAILED open or read
chr17.fa.gz: OK
md5sum: chr17_random.fa.gz: No such file or directory
chr17_random.fa.gz: FAILED open or read
chr18.fa.gz: OK
chr19.fa.gz: OK
md5sum: chr1_random.fa.gz: No such file or directory
chr1_random.fa.gz: FAILED open or read
chr2.fa.gz: OK
chr3.fa.gz: OK
md5sum: chr3_random.fa.gz: No such file or directory
chr3_random.fa.gz: FAILED open or read
chr4.fa.gz: OK
md5sum: chr4_random.fa.gz: No such file or directory
chr4_random.fa.gz: FAILED open or read
chr5.fa.gz: OK
md5sum: chr5_random.fa.gz: No such file or directory
chr5_random.fa.gz: FAILED open or read
chr6.fa.gz: OK
chr7.fa.gz: OK
md5sum: chr7_random.fa.gz: No such file or directory
chr7_random.fa.gz: FAILED open or read
chr8.fa.gz: OK
md5sum: chr8_random.fa.gz: No such file or directory
chr8_random.fa.gz: FAILED open or read
chr9.fa.gz: OK
md5sum: chr9_random.fa.gz: No such file or directory
chr9_random.fa.gz: FAILED open or read
chrM.fa.gz: OK
md5sum: chrUn_random.fa.gz: No such file or directory
chrUn_random.fa.gz: FAILED open or read
chrX.fa.gz: OK
md5sum: chrX_random.fa.gz: No such file or directory
chrX_random.fa.gz: FAILED open or read
chrY.fa.gz: OK
md5sum: chrY_random.fa.gz: No such file or directory
chrY_random.fa.gz: FAILED open or read
md5sum: WARNING: 13 listed files could not be read
xingkx 18:00:31 ~/ref/mm9
$ gunzip *gz  #解壓當(dāng)前目錄下的所有g(shù)z文件
xingkx 18:01:22 ~/ref/mm9

$ ls  #解壓成功，全部以fa結(jié)尾
chr10.fa  chr13.fa  chr16.fa  chr19.fa  chr3.fa  chr6.fa  chr9.fa  chrY.fa
chr11.fa  chr14.fa  chr17.fa  chr1.fa   chr4.fa  chr7.fa  chrM.fa  md5.txt
chr12.fa  chr15.fa  chr18.fa  chr2.fa   chr5.fa  chr8.fa  chrX.fa
xingkx 18:01:58 ~/ref/mm9
$ cat *fa > mm9.fa  #將所有fa文件重定向到mm9.fa,拼接起來(lái)
xingkx 18:02:39 ~/ref/mm9
$ ls #重定向后港粱，原來(lái)的文件依然存在
chr10.fa  chr14.fa  chr18.fa  chr3.fa  chr7.fa  chrX.fa  mm9.fa.fai
chr11.fa  chr15.fa  chr19.fa  chr4.fa  chr8.fa  chrY.fa  nohup.out
chr12.fa  chr16.fa  chr1.fa   chr5.fa  chr9.fa  md5.txt
chr13.fa  chr17.fa  chr2.fa   chr6.fa  chrM.fa  mm9.fa
(chipseq) xingkx 19:21:38 ~/ref/mm9

激活chipseq環(huán)境螃成，使用samtools工具

conda activate chipseq
samtools
samtools faidx mm9.fa
ls

$ cat mm9.fa.fai
chr10   129993255       7       50      51
chr11   121843856       132593135       50      51
chr12   121257530       256873876       50      51
chr13   120284312       380556564       50      51
chr14   125194864       503246570       50      51
chr15   103494974       630945339       50      51
chr16   98319150        736510220       50      51
chr17   95272651        836795760       50      51
chr18   90772031        933973872       50      51
chr19   61342430        1026561351      50      51
chr1    197195432       1089130636      50      51
chr2    181748087       1290269983      50      51
chr3    159599783       1475653038      50      51
chr4    155630120       1638444823      50      51
chr5    152537259       1797187552      50      51
chr6    149517037       1952775563      50      51
chr7    152524553       2105282947      50      51
chr8    131738871       2260857998      50      51
chr9    124076172       2395231653      50      51
chrM    16299   2521789355      50      51
chrX    166650296       2521805986      50      51
chrY    15902555        2691789294      50      51
(chipseq) xingkx 19:28:35 ~/ref/mm9

使用bowtie2工具比對(duì)工具,bowtie2-build構(gòu)建索引

 345  bowtie
 346  bowtie2
 347  bowtie2-build -h
 348  nohup bowtie2-build --threads 4 mm9.fa mm9 & #線程數(shù)是4，前綴是mm9

image.png

表示任務(wù)跑完了 1.bg 2.top
bg命令來(lái)自于英文單詞background的縮寫查坪，中文譯為“背景寸宏、后臺(tái)”，其功能是用于將作業(yè)放到后臺(tái)運(yùn)行偿曙。在Linux系統(tǒng)終端中執(zhí)行命令時(shí)氮凝，如遇到備份、打包望忆、下載等長(zhǎng)時(shí)間的任務(wù)罩阵，就會(huì)很長(zhǎng)一段時(shí)間占用寶貴的終端執(zhí)行界面，無(wú)法執(zhí)行其他任務(wù)炭臭。而bg命令則可以將指定的命令任務(wù)放到系統(tǒng)后臺(tái)去執(zhí)行永脓，使得終端界面可以繼續(xù)其他工作，效果等同于“命令 &”的執(zhí)行效果鞋仍。

$ ls
chr10.fa  chr15.fa  chr1.fa  chr6.fa  chrX.fa    mm9.3.bt2      mm9.rev.2.bt2
chr11.fa  chr16.fa  chr2.fa  chr7.fa  chrY.fa    mm9.4.bt2      nohup.out
chr12.fa  chr17.fa  chr3.fa  chr8.fa  md5.txt    mm9.fa
chr13.fa  chr18.fa  chr4.fa  chr9.fa  mm9.1.bt2  mm9.fa.fai
chr14.fa  chr19.fa  chr5.fa  chrM.fa  mm9.2.bt2  mm9.rev.1.bt2
xingkx 09:24:49 ~/ref/mm9

bt2結(jié)尾的文件常摧，索引構(gòu)建成功

$ cd clean #使用剪切過(guò)后的文件
(chipseq) xingkx 22:58:19 ~/chipseq/clean
$ ls
fastqc  SRR391033.fastq.gz_trimming_report.txt  SRR391033_trimmed.fq.gz
(chipseq) xingkx 22:58:21 ~/chipseq/clean

$ bowtie2 -p 20 -x ../../ref/mm9/mm9 -U SRR391033_trimmed.fq.gz -b ../align/sRR391033.bam 
# 最后一個(gè)mm9指前綴
Warning: Output file '../align/sRR391033.bam' was specified without -S.  This will not work in future Bowtie 2 versions.  Please use -S instead.
0 reads
0.00% overall alignment rate
(chipseq) xingkx 23:03:40 ~/chipseq/clean
$ bowtie2 -p 20 -x ../../ref/mm9/mm9 -U SRR391033_trimmed.fq.gz -S ../align/SRR391033.sam 
#bam文件不行，使用sam文件
Error while flushing and closing output
terminate called after throwing an instance of 'int'
Aborted (core dumped)
(ERR): bowtie2-align exited with value 134
(chipseq) xingkx 23:05:21 ~/chipseq/clean

假設(shè)你發(fā)現(xiàn)前臺(tái)運(yùn)行的一個(gè)程序需要很長(zhǎng)的時(shí)間,但是需要干其他的事情,你就可以用 Ctrl-Z ,終止這個(gè)程序,然后可以看到系統(tǒng)提示:

[1]+ Stopped /root/bin/rsync.sh

然后我們可以把程序調(diào)度到后臺(tái)執(zhí)行:(bg 后面的數(shù)字為作業(yè)號(hào))

#bg 1

[1]+ /root/bin/rsync.sh &

用 jobs 命令查看正在運(yùn)行的任務(wù):

#jobs

[1]+ Running /root/bin/rsync.sh &

如果想把它調(diào)回到前臺(tái)運(yùn)行,可以用

#fg 1

/root/bin/rsync.sh

這樣,你在控制臺(tái)上就只能等待這個(gè)任務(wù)完成了.

& 將指令丟到后臺(tái)中去執(zhí)行

[ctrl]+z 將前臺(tái)任務(wù)丟到后臺(tái)中暫停

jobs 查看后臺(tái)的工作狀態(tài)

fg %jobnumber 將后臺(tái)的任務(wù)拿到前臺(tái)來(lái)處理

bg %jobnumber 將任務(wù)放到后臺(tái)中去處理

kill 管理后臺(tái)的任務(wù)

命令運(yùn)行時(shí)使用CTRL+Z威创，強(qiáng)制當(dāng)前進(jìn)程轉(zhuǎn)為后臺(tái)落午，并使之停止。

ctrl+z 加 bg 效果等同于 nohup &

image.png

存儲(chǔ)空間問(wèn)題肚豺，home下你個(gè)人就6G的空間溃斋，mnt下你應(yīng)該會(huì)有幾T的空間，限制不一樣的吸申，把chipseq 文件夾移動(dòng)到/mnt,然后重新跑任務(wù)

cp /home/xingkx/chipseq /mnt/disk4/xingkx

$ conda create -n chipseq2 python=3.9 
Retrieving notices: ...working... done
Collecting package metadata (current_repodata.json): failed

CondaHTTPError: HTTP 000 CONNECTION FAILED for url <https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/linux-64/current_repodata.json>
Elapsed: -

An HTTP error occurred when trying to retrieve this URL.
HTTP errors are often intermittent, and a simple retry will get you on your way.
'https//mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/linux-64'


(chipseq) xingkx 22:44:00 /mnt/disk4/xingkx/chipseq/align

bowtie2 -p 1 -x /home/xingkx/ref/mm9/mm9 -U SRR391033_trimmed.fq.gz -S /home/xingkx/chipseq/align/test.sam

image.png

線程數(shù)改小梗劫，移動(dòng)到home目錄下跑

查看sam文件的兩種方式：

 less SRR391033.sam 
 samtools view SRR391033.sam |less

sam文件轉(zhuǎn)bam文件，使用samtools工具,bam 文件是排過(guò)序的

samtools sort -o SRR391033.sort.bam -O BA M -@ 4 SRR391033.sam

查看bam 文件：

less SRR391033.sort.bam 
samtools view SRR391033.sort.bam |less

bam文件各列的含義：
https://www.cnblogs.com/xudongliang/p/5437850.html

使用macs2 call peak

macs2 callpeak -t SRR391033.sort.bam -g mm --outdir ../peaks/ -n SRR391033 -q 0.05

這里有p value,q value的概念截碴，多重校正梳侨，q是校正過(guò)后的p值

報(bào)錯(cuò)
python 版本是2.7,改成3

python -V
pip install numpy -U  #Python使用pip安裝Numpy模塊
conda create chipseq2 python=3.9

image.png

一直因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)問(wèn)題報(bào)錯(cuò) 服務(wù)器沒(méi)聯(lián)網(wǎng)

?著作權(quán)歸作者所有,轉(zhuǎn)載或內(nèi)容合作請(qǐng)聯(lián)系作者

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序言：一個(gè)原本活蹦亂跳的男人離奇死亡火脉，死狀恐怖牵舵，靈堂內(nèi)的尸體忽然破棺而出，到底是詐尸還是另有隱情倦挂，我是刑警寧澤畸颅，帶...
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?日本核電站爆炸內(nèi)幕
正文年R本政府宣布，位于F島的核電站方援，受9級(jí)特大地震影響没炒，放射性物質(zhì)發(fā)生泄漏。R本人自食惡果不足惜犯戏，卻給世界環(huán)境...
茶點(diǎn)故事閱讀 41,437評(píng)論 3贊 331
男人毒藥：我在死后第九天來(lái)索命
文/蒙蒙一送火、第九天我趴在偏房一處隱蔽的房頂上張望。院中可真熱鬧先匪，春花似錦种吸、人聲如沸。這莊子的主人今日做“春日...
開(kāi)封第一講書人閱讀 31,993評(píng)論 0贊 22
一樁弒父案坚俗，背后竟有這般陰謀
文/蒼蘭香墨我抬頭看了看天上的太陽(yáng)。三九已至姜钳，卻和暖如春坦冠，著一層夾襖步出監(jiān)牢的瞬間，已是汗流浹背哥桥。一陣腳步聲響...
開(kāi)封第一講書人閱讀 33,107評(píng)論 1贊 271
情欲美人皮
我被黑心中介騙來(lái)泰國(guó)打工辙浑，沒(méi)想到剛下飛機(jī)就差點(diǎn)兒被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留，地道東北人拟糕。一個(gè)月前我還...
沈念sama閱讀 48,308評(píng)論 3贊 372
代替公主和親
正文我出身青樓判呕，卻偏偏與公主長(zhǎng)得像，于是被迫代替她去往敵國(guó)和親送滞。傳聞我的和親對(duì)象是個(gè)殘疾皇子侠草，可洞房花燭夜當(dāng)晚...
茶點(diǎn)故事閱讀 45,037評(píng)論 2贊 355

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