文章概覽

題目：Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq

中文題目：通過單細胞轉錄組學解析IDH突變型膠質瘤的遺傳嘉赎、譜系和微環(huán)境特征

第一作者：Andrew S. Venteicher, Itay Tirosh

通訊作者：Aviv Regev, Mario L. Suvà

日期：2017.3.31

被引次數(shù)：436

期刊：Science

影響因子：41.845

引言

在成人中雾狈，根據(jù)綜合遺傳和組織學參數(shù)將彌漫性膠質瘤分為三大類：IDH-野生型膠質母細胞瘤 (GBM) 是該疾病最普遍和最具侵襲性的形式笋颤，而IDH1（或較少見的IDH2?) 突變包含了兩大類神經(jīng)膠質瘤：星形細胞瘤 (IDH-A) 和少突膠質細胞瘤 (IDH-O) 鸽捻。IDH-A 和 IDH-O 是兩種不同的腫瘤類型，它們的遺傳夯接、組織病理學和預后上有所不同。

從遺傳上講，IDH-A 的特征是TP53和ATRX突變舷嗡，而 IDH-O 的特征是TERT啟動子突變和染色體臂 1p 和 19q 丟失。在組織病理學中嵌莉，IDH-A 和 IDH-O 也是不同的进萄，被認為主要分別概括了星形膠質細胞和少突膠質細胞的分化譜系。少突膠質細胞（例如，OLIG2）和星形膠質細胞（例如中鼠，膠質纖維酸性蛋白 (GFAP)）標志物的表達在這兩種疾病中都可以很容易地識別可婶，但在單個腫瘤中，具有腫瘤性星形膠質細胞和少突膠質細胞的組織學特征細胞混合物經(jīng)常出現(xiàn)援雇。因此矛渴，這兩種不同膠質瘤獨立遵循神經(jīng)膠質譜系的假設是有問題的。

在這里惫搏，作者將 10 個 IDH-A 神經(jīng)膠質瘤樣本的 9879 個細胞（經(jīng)過質控后保留了 6341 個單細胞）和 6 個 IDH-O 神經(jīng)膠質瘤樣本的 4347 個細胞（先前的研究）的scRNA-seq和 165 個 TCGA bulk RNA-seq相結合具温，以破譯癌細胞基因型和表型，并深入了解 IDH-突變膠質瘤筐赔。樣本信息如下铣猩。

樣本信息

結果發(fā)現(xiàn)，IDH-A 和 IDH-O 之間的差異主要是由特定的遺傳事件和不同的TME組成來解釋的茴丰，而不是由兩種腫瘤類型的惡性細胞中神經(jīng)膠質譜系的不同影響來解釋的达皿。此外，隨著神經(jīng)膠質瘤分級的增加贿肩，我們觀察到惡性細胞增殖增強峦椰、未分化神經(jīng)膠質瘤細胞池增多，以及 TME 中巨噬細胞相對于小膠質細胞程序的增加尸曼。

本文的研究思路如下：

圖1 研究思路

使用scRNA-seq 破解 IDH 突變膠質瘤樣本之間的差異

為了區(qū)分惡性細胞和正常細胞们何，作者使用了層次聚類和CNV結合判斷的方法，通過基因表達的層次聚類可以將細胞分成三組：腫瘤細胞控轿、少突膠質細胞和小膠質細胞冤竹。通過CNV的預測可以驗證惡性細胞判斷的準確性。WES和FISH驗證了CNV的結果茬射。使用這兩個標準鹦蠕，識別 5097 個惡性細胞。

圖2 細胞分類

Bulk IDH-A 和 IDH-O 膠質瘤樣本間的許多差異并非源于惡性細胞

作者首先使用來自 TCGA 數(shù)據(jù)集的76 個 IDH-O 和 91 個 IDH-A 膠質瘤的bulk RNA-seq表達譜進行了差異表達分析在抛，發(fā)現(xiàn)了約 550 個差異表達的基因钟病，表明存在不同的調控程序。但因為他代表了樣本的平均水平刚梭，因此作者又進行了惡性細胞單細胞的差異表達分析肠阱。但發(fā)現(xiàn)bulk RNA-seq中差異表達的基因只有大約一半存在于惡性細胞單細胞的差異表達基因中，說明其他的差異來源于小膠質細胞/巨噬細胞marker基因和神經(jīng)元marker基因朴读。與 IDH-O 腫瘤相比屹徘，IDH-A 腫瘤具有更多的小膠質細胞/巨噬細胞和更少的神經(jīng)元。

圖3 IDH-A 和 IDH-O 的差異表達

IDH-A 和 IDH-O 惡性細胞間的表達差異大多來源于遺傳因素

特定的遺傳事件決定了兩種膠質瘤的一些差異衅金。比如在 IDH-A 中噪伊，惡性細胞中具有較高表達的大多數(shù)基因位于染色體 1p 和 19q 上簿煌，然而它們在 IDH-O 中是缺失的。CIC基因功能的缺失在IDH-O中具有大約10%的差異鉴吹，作者還發(fā)現(xiàn)p53突變在兩者中也起很大作用姨伟。

scRNA-seq 揭示了 IDH-A 和 IDH-O 中共享的神經(jīng)膠質譜系

IDH-A 和 IDH-O 被認為主要分別概括了星形膠質細胞和少突膠質細胞譜系。但是上述結果表明 IDH-A 和 IDH-O 之間的大部分差異可能是由遺傳因素和 TME 引起的豆励，不符合這些腫瘤有著不同神經(jīng)膠質譜系的假設夺荒。事實上，作者觀察到 IDH-A 和 IDH-O 之間AC的marker基因和OC的marker基因的差異表達有限（圖4A）肆糕。相反般堆，這些基因的表達在 IDH-A 和 IDH-O 腫瘤中的每一個細胞中有很大差異。減去瘤間差異后诚啃，所有 IDH-A 細胞的主成分分析 (PCA) 表明主成分 PC1 和 PC2 與星形膠質細胞特異性 (PC1/2-high) 和少突膠質細胞特異性 (PC1/2-low) 基因相關（圖4B）

圖4?

為了更精確地分類腫瘤細胞，作者定義了膠質細胞譜系基因來區(qū)分AC-like和OC-like細胞私沮。這些表達程序使用另外經(jīng)過10X Genomics測序的3538個IDH-A細胞產(chǎn)生始赎，并且也在IDH-O的細胞中表達（圖5）。經(jīng)過對每種腫瘤中的單個細胞進行這些程序的表達評分仔燕，然后使用這些分數(shù)對每個程序的優(yōu)先表達以及中間細胞狀態(tài)的細胞進行分類（圖5C）造垛。可以看到所有腫瘤都表現(xiàn)出廣泛的細胞狀態(tài)分布晰搀，但?IDH-A 的中間狀態(tài)細胞更多五辽。IDH野生型GBM的細胞類型分布與IDH突變型膠質瘤也非常不同，GBM顯示出最高的Astro程序偏好性（圖5B）外恕。

圖5

作者接下來研究IDH-A 和 IDH-O 惡性細胞之間差異表達的 192 個基因是否在所有惡性細胞中共同存在杆逗，結果發(fā)現(xiàn)，可歸因于標志性遺傳改變的 109 個基因的表達差異在所有惡性細胞中共享鳞疲。然而罪郊，IDH-A 和 IDH-O 在其余 83 個差異基因的表達在已分化的腫瘤細胞中差異最明顯，而在大多數(shù)未分化的癌細胞中幾乎完全消失（也就是說未分化的細胞差異并不大）尚洽，這也說明了?IDH-A 和 IDH-O 有著共同的細胞起源的可能性悔橄。

為了進一步驗證這一假設，我們分析了?整體的?DNA甲基化模式腺毫，因為 DNA 甲基化數(shù)據(jù)會保留基因表達差異不明顯的起始細胞的表觀遺傳特征癣疟。作者發(fā)現(xiàn)，IDH-A 和 IDH-O 之間的 DNA 甲基化高度相似潮酒，盡管 DNA 甲基化受IDH突變的影響很大睛挚。

未分化的腫瘤細胞與“增殖”程序和共享的“干性”程序有關

在 IDH-A 和 IDH-O 中，只有一小部分細胞在增殖澈灼，而且增殖和分化之間負相關竞川，增殖和干性之間正相關（圖6A）店溢。作者將推定的神經(jīng)膠質瘤干細胞程序定義為在 IDH-A 和 IDH-O 的未分化細胞中富集和共表達的基因子集（圖6C）。該程序包括神經(jīng)發(fā)育轉錄因子（例如 SOX4委乌、SOX11 和 TCF4）床牧，并且與人類神經(jīng)干細胞 (NSC) 和神經(jīng)祖細胞 (NPC) 的表達程序一致，還與之前在 IDH-O 研究中的程序一致遭贸。

染色實驗結果表明戈咳，AC和OC譜系的marker（APOE和APOD）互斥表達；AC譜系和“增殖”的marker（APOE和Ki67）互斥表達壕吹；“增殖”和“干性/祖細胞”的marker（Ki67和SOX9）共表達（圖6C）著蛙。

圖6

與腫瘤分級和遺傳亞克隆相關的腫瘤細胞結構的差異

盡管 IDH-A 和 IDH-O 共享相同的干/祖細胞程序和假定的神經(jīng)膠質分化譜系，但還是可以在組織中觀察到區(qū)域和腫瘤間的異質性耳贬。IDH-A和IDH-O腫瘤的比較揭示三個主要區(qū)別：（1）IDH-A中cycling細胞的總體比例更高踏堡；（2）IDH-A中未分化細胞的總體比例更高；（3）在IDH-O中咒劲，同一個細胞中AC和OC譜系的評分負相關（這與膠質發(fā)生中一個譜系會抑制另一個譜系的特征相一致）顷蟆，但這種特征在IDH-A中沒有被觀察到腐魂。

IDH-A 在三個方面都存在與腫瘤分級相關的顯著差異帐偎，較高級別的腫瘤往往具有更多的cycling細胞、更多的未分化細胞以及AC和OC譜系程序之間更有限的聯(lián)系（圖7A）蛔屹。通過對大量 TCGA 樣本的分析驗證了循環(huán)惡性細胞的比例與腫瘤等級之間的相關性削樊。

與腫瘤分級相關的特征可能也會在同一腫瘤的不同亞克隆中存在，圖7B和7C顯示了不同亞克隆的分化模式和cycling細胞比例的不同兔毒。

圖7

總體來說漫贞，這些結果都表明分化和增殖的模式部分收到遺傳因素的影響。未來的研究應進一步探究遺傳進化對細胞結構有哪些具體影響眼刃。

膠質瘤 TME 中的小膠質細胞與巨噬細胞的平衡

作者最后使用 PCA 來分析小膠質細胞/巨噬細胞的多樣性绕辖，小膠質細胞/巨噬細胞是 TME 中非惡性細胞的主要子集（IDH-A,?n?= 1043，IDH-O,?n?= 246）擂红。PC2反映了由細胞因子（白介素IL-1仪际，IL-8，腫瘤壞死因子TNF）昵骤、趨化因子 (CCL3 和 CCL4)树碱、NF-κB 相關基因（REL、NFKBIA 和 NFKBIZ）和即刻早期基因（JUNB变秦、FOSB成榜、EGR3、IER3 和 ATF3）組成的炎癥程序蹦玫。該程序在 IDH-A 和 IDH-O 腫瘤中的大多數(shù)小膠質細胞/巨噬細胞中都很活躍赎婚，并且類似于 IDH-O 中報道的程序刘绣。

即刻早期基因（Immediate early genes ， IEGs）細胞經(jīng)外部刺激后最先表達的一組基因挣输，是聯(lián)系細胞生化改變與細胞最終對刺激發(fā)生特異性反應的中介物纬凤。不僅參與細胞的正常生長、分化過程撩嚼，而且也參與細胞內(nèi)信息傳遞過程和細胞的能量代謝過程停士，在學習記憶中起著極為重要的作用。IEGs不同于“晚期反應”基因完丽，后者只有在早期反應基因產(chǎn)物合成后才會被激活恋技。因此，IEGs被稱為“通往基因組反應的門戶”逻族。這些基因的激活不需要蛋白質的從頭合成蜻底。代表基因有Fos, Zif268, Arc, Homer1a等。 這些基因中的一些產(chǎn)物能夠把細胞從靜止的G0期喚醒聘鳞，從而進入活躍期朱躺。

PC1 突出了兩個相互對立的程序，它們與小膠質細胞 (PC1-high) 和巨噬細胞 (PC1-low) 表達程序高度一致（圖8A）搁痛。高 PC1 基因包括小膠質細胞marker，例如 CX3CR1宇弛、P2RY12 和 P2RY13鸡典。而 CD163、TGFBI 和 F13A1 屬于低 PC1 基因枪芒，并且在不同巨噬細胞群中的表達高于小膠質細胞彻况。因此，PC1-high 和 PC1-low 之間的差異可能對應于大腦駐留的小膠質細胞與通過血腦屏障滲透到達腫瘤的浸潤性巨噬細胞的不同舅踪。

通過小膠質細胞特異性基因與巨噬細胞特異性基因的相對表達對細胞進行評分顯示出連續(xù)的分布而不是雙峰分布（圖8B）纽甘。因此小膠質細胞和巨噬細胞之間沒有明顯的分界線。圖8C顯示了膠質瘤的巨噬細胞與黑色素瘤的腫瘤巨噬細胞（頂部）的巨大差異抽碌。因此悍赢，膠質瘤微環(huán)境可能改變了巨噬細胞的表達譜，從而減少了它們與小膠質細胞的差異货徙。此外左权，來自每個個體腫瘤的小膠質細胞/巨噬細胞的評分范圍有限，一些腫瘤偏向于巨噬細胞-like細胞痴颊，（例如 MGH42）赏迟，而其他腫瘤偏向于小膠質細胞-like細胞（例如 MGH56）（圖8C）。這些表明不同腫瘤的微環(huán)境的特征由免疫細胞的不同起源決定蠢棱。

圖8

總之锌杀，更高級別的膠質瘤對應著更高的比例的巨噬細胞甩栈。考慮到血管生成也是更高級別膠質瘤的特征之一糕再，作者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞（血管）的基因表達和巨噬細胞而非小膠質細胞的基因表達相關（圖8D, E）量没。最后，作者通過對 CX3CR1（小膠質細胞）和 CD163（巨噬細胞）進行 RNA 原位雜交驗證了我們的觀察結果（圖8F）亿鲜，結果表明MGH56含有更多小膠質細胞允蜈，而沒有巨噬細胞，MGH43中小膠質細胞和巨噬細胞的marker都表達蒿柳，MGH42只有巨噬細胞的marker饶套。最后，與 IDH-O 相比垒探，IDH-A 中小膠質細胞/巨噬細胞的浸潤總體增加妓蛮。

盡管內(nèi)皮細胞的程序與巨噬細胞的表達程序相關，但并不能完全解釋小膠質細胞和巨噬細胞總體比例的變異性圾叼。為了尋找與TAM豐度相關的因素蛤克，作者在bulk中腫瘤數(shù)據(jù)中尋找了到了24個在TAM中不表達但與TAM豐度相關的基因，該表達程序可以較好的預測TAM的浸潤程度和腫瘤類型夷蚊，但依然不能確定是否存在因果關系构挤。有趣的是，其中三個基因是補體系統(tǒng)的組成部分惕鼓，這與在黑色素瘤中成纖維細胞 - 免疫細胞相互作用的類似分析中所觀察到的類似筋现。

本文提到的marker基因

OC:?MBP, MOBP, PLLP, ?CLDN11

OC lineage:?OLIG2, APOD

AC: GFAP

AC lineage: APOE

Proliferation: MKI67

Stem/progenitor:?SOX4

Microglia:?CX3CR1, P2RY12, P2RY13

Macrophage:?CD163, TGFBI, F13A1

本文的附錄S3（aai8478-table-s3.xlsx）列舉了腫瘤細胞的marker

參考

https://science.sciencemag.org/content/355/6332/eaai8478