眾所周知哨啃，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用來操縱基因組：規(guī)律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合劲弦，可以在引導RNA（gRNA）的指引下邑跪，靶向基因組中的特定區(qū)域并切割DNA画畅，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）宋距。
自2013年谚赎，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用又得到了更廣泛的擴展，我們可以將Cas9帶到特定的基因組位點棕所，通過起始或停止轉(zhuǎn)錄來調(diào)控靶基因琳省，達到激活或抑制基因表達的目的
從“CRISPR編輯”到“CRISPR調(diào)節(jié)”
實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變的核心仍舊是Cas9针贬，只是編輯基因組需要具有內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白，而調(diào)節(jié)基因表達時需要催化功能失活的“dead”Cas9 —— dCas9塌碌。這種突變（D10A，H840A）的Cas9蛋白雖然不能進行DNA雙鏈的切割嗓节，但仍舊可以在gRNA的指導下與特定靶向的DNA緊緊結合拦宣。
圖1. dCas9結構示意圖鸵隧。
當使用dCas9蛋白與不同的效應結構域連接豆瘫，而gRNA與我們想要抑制或激活的靶基因區(qū)域互補時外驱，我們就可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來調(diào)節(jié)靶基因的表達了昵宇。
圖2. dCas9介導的基因調(diào)控系統(tǒng)。圖片來自：Cell. 2013 Jul 18; 154(2): 442–451.
CRISPRi
CRISPRi也稱為CRISPR干擾 (CRISPR interference or inhibition) 儿子。dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制子連接瓦哎，如KRAB（Kruppel associated box），dCas9-KRAB融合蛋白在gRNA指引下，結合到靶基因TSS位點蒋譬，抑制轉(zhuǎn)錄起始割岛，沉默靶基因的表達。
圖3. CRISPRi系統(tǒng)示意圖蜂桶。圖片來自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.
CRISPRi 研究案例
dCas9融合KRAB的CRISPRi系統(tǒng)（dCas9-KRAB）在海馬神經(jīng)元中能有效地靶向抑制功能基因的表達，基因沉默水平顯著優(yōu)于傳統(tǒng)RNAi技術也切。
Fig1. CRISPRi efficiently inactivates gene expression in primary neurons.
利用神經(jīng)元亞群特異性的啟動子條件性CRISPRi能精確控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經(jīng)元中喪失功能而不影響Syt1在其它類型細胞中的表達。
Fig2. CRISPRi-based conditional inactivation of Syt1 shifts the E-I balance of the DG.
針對Syt1及其互作蛋白網(wǎng)絡的基因Syb2腰湾，Stx1a/b和SNAP25a的多重基因CRISPRi系統(tǒng)能夠在小鼠腦內(nèi)實現(xiàn)靈活多變的多基因不同組合的高效失活雷恃。
Fig3. Flexible multiplex gene silencing using CRISPRi in the mouse brain.
最新的研究在dCas9-KRAB的基礎上進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)dCas9-KRAB-MeCP2能夠更高效地對靶基因表達的抑制费坊。
Fig4. Repression of endogenous genes by dCas9–KRAB–MeCP2.
參考文獻：
Zheng Y, Shen W, Zhang J, Yang B, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):447-454.
Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y倒槐，et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018 Jul 16. doi: 10.1038/s41592-018-0048-5.
CRISPRa
CRISPRa也稱為CRISPR激活 (CRISPR activation) 。讓dCas9與不同的轉(zhuǎn)錄激活子結合發(fā)揮上調(diào)靶基因表達的作用附井。例如讨越，直接與單個轉(zhuǎn)錄激活因子（例如dCas9-VP64或dCas9-VP16）融合表達，不過單轉(zhuǎn)錄激活因子對靶基因地激活水平降低永毅。為了更好地提高過表達的水平把跨，可將多個轉(zhuǎn)錄激活因子共同招募到靶基因TSS位點：如多拷貝VP64與dCas9的融合、三元轉(zhuǎn)錄激活因子VPR（VP64-p65-Rta）融合到dCas9末端沼死。
除了將轉(zhuǎn)錄激活因子直接與dCas9融合以外着逐，還可以通過分子掛鉤來招募轉(zhuǎn)錄激活因子到dCas9周圍，如：將SunTag短肽（含多拷貝的GCN4激活招募結構域）與dCas9融合意蛀，來招募scFvGCN4-sfGFP-VP64耸别。或利用SAM系統(tǒng)县钥，將MS2發(fā)夾結構融合到gRNA上秀姐，招募激活輔助蛋白（MS2-p65-HSF1）到dCas9-VP64融合蛋白上，提高激活效率若贮。
圖4. CRISPRa系統(tǒng)示意圖省有。圖片來自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.
在今年初的Nature Neuroscience上，一種新的CRISPRa系統(tǒng)被建立并應用——dCas9-SPH兜看。將SunTag-p65-HSF1與dCas9融合锥咸，并利用Cre-loxP系統(tǒng)，建立了一種可受Cre誘導的dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠细移。
CRISPRa 研究案例
dCas9-VPR
dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子融合轉(zhuǎn)錄增強結果顯示搏予，融合三個轉(zhuǎn)錄激活因子的增強的效果明顯高于融合單個轉(zhuǎn)錄激活因子。
Fig1. Serial fusion of activation domains to dCas9.
VPR連接順序是轉(zhuǎn)錄激活的影響因子弧轧，當順序為VP64-p65-Rta時雪侥，轉(zhuǎn)錄激活效果最明顯碗殷。
Fig2. Testing the effects of VP64, p65 and Rta order on activation.
檢測人類293T細胞中的MIAT、NEUROD1速缨、ASCL1锌妻、RHOXF2、TTN旬牲、ACTC1基因仿粹，結果顯示dCas9結合轉(zhuǎn)錄增強子對不同的基因激活程度不同。
Fig3. Gene activation using VPR.
參考文獻：
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.
dCas9-SPH
將SunTag-p65-HSF1 (SPH)融合到dCas9蛋白上原茅，分別在人和小鼠的細胞里驗證了dCas9-SPH系統(tǒng)的高效性以及特異性吭历。
Fig1. Design of an improved activator SPH.
Fig2. mCherry driven by a minimal CMV promoter was activated in HEK293T and N2a cells by the indicated dCas9 activation systems.
構建受Cre重組酶調(diào)控的dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠，在dCas9-SPH小鼠的原代細胞里導入sgRNA可以激活基因和長鏈非編碼RNA擂橘。
Fig3. Generation of a Cre-dependent SPH transgenic mouse and activation of genes and lncRNAs in primary cells.
通過向dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠腦部定點注射靶向三個轉(zhuǎn)錄因子（ANN）Ascl1晌区，Neurog2、Neurod1的AAV-sgRNA通贞，結果顯示ANN轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)朗若，星形膠質(zhì)細胞可以直接被轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元。
Fig4. SPH-based targeted activations convert astrocytes into functional neurons in vivo.
向dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠腦部定點注射靶向多個基因以及長鏈非編碼RNA的AAV-sgRNA陣列昌罩，可實現(xiàn)多個基因在神經(jīng)元內(nèi)的同時激活哭懈。
Fig5. Complex transcriptional activation in the intact brain using a single sgRNA array.
參考文獻：
Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446.
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的應用
基因表達降低（Knockdown）：適用于編碼和非編碼基因∠棵裕可與CRISPR-KO或RNAi互補银伟。
基因過表達（Overexpression）：適用于編碼和非編碼基因』娓悖可實現(xiàn)基因在內(nèi)源環(huán)境中過表達彤避。
基因定位：dCas9與熒光蛋白融合表達，可以對靶基因所在的染色體定位進行示蹤夯辖。
誘導iPS：可利用CRISPRi來誘導iPS琉预，或大規(guī)模篩選細胞全能性相關基因。
高通量遺傳篩選：可以利用CRISPRi/CRISPRa找到腫瘤細胞中的調(diào)節(jié)通路或易感基因蒿褂、鑒定組織發(fā)育或細胞分化中的重要基因圆米。
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的優(yōu)勢
dCas9介導的基因調(diào)控是可逆的，不會永久性地修飾基因組DNA啄栓。
CRISPRi/CRISPRa復合物必須在轉(zhuǎn)錄起始位點附近才能發(fā)揮作用娄帖，因此降低了脫靶效應。
設計多條gRNAs可同時對多個靶基因進行調(diào)控昙楚。
CRISPRi的作用類似于RNAi近速，但又不同于RNAi。RNAi針對成熟的RNA，而CRISPRi則是在DNA水平阻止轉(zhuǎn)錄的起始削葱。因此奖亚，與RNAi相比，可靶向lncRNA析砸、microRNA昔字、反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本等首繁，是研究非蛋白編碼基因的有力工具作郭。
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的局限性
PAM序列在一定程度上限制了結合靶序列的數(shù)量。
染色體狀態(tài)和修飾可能會影響dCas9-gRNA與DNA的結合蛮瞄。
哺乳動物細胞中所坯，不同基因的CRISPRi/CRISPRa的效率差異性較大。
當靶基因的靶序列與其它基因重疊挂捅，或受雙向啟動子調(diào)節(jié)時，CRISPRi/CRISPRa的調(diào)控可能會影響到周邊的基因表達堂湖。
dCas9介導的體內(nèi)基因沉默/激活工具小鼠來啦闲先！
南模生物dCas9系列工具鼠，可幫助研究者實現(xiàn)多靶點无蜂、可逆伺糠、內(nèi)源蛋白編碼基因以及長鏈非編碼RNA的調(diào)控。
CRISPRi 工具鼠
- CAG-LSL-KRAB-dCas9
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-KRAB-dCas9-IRES-EGFP)Smoc
目錄號：NM-KI-18007
品系描述：將CAG-LSL-2xKRAB-dCas9-IRES-EGFP-WPRE-pA定點插入到小鼠Rosa26基因中斥季，建立受Cre表達誘導的CRISPRi基因表達調(diào)控工具小鼠训桶。與Cre工具鼠交配后，在Cre表達的細胞內(nèi)酣倾，可通過gRNA靶向并沉默目的基因舵揭。
CRISPRa 工具鼠
- CAG-LSL-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-dCas9-VPR-IRES-EGFP-WPRE-pA)Smoc
目錄號：NM-KI-18004
品系描述：將CAG-LoxP-STOP-LoxP-dCas9-VP64-p65-Rta-IRES-EGFP-WPRE-polyA結構插入到Rosa26基因中，建立受Cre表達誘導的CRISPRa基因表達調(diào)控工具小鼠躁锡。與Cre工具鼠交配后午绳，在Cre表達的細胞內(nèi)，可通過gRNA靶向并增強目的基因的表達映之。
- TRE3G-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Col1a1em1(TRE3G-dCas9-VPR-eGFP-pA)Smoc
目錄號：NM-KI-00123
品系描述：將TRE3G-dCas9-VP64-p65-Rta-eGFP-pA四環(huán)素調(diào)控表達dCas9激活元件插入到安全位點Col1a1位點中拦焚。與rtTA工具鼠交配后，可在強力霉素dox誘導下在rtTA表達的細胞中杠输，通過gRNA靶向并增強目的基因的表達赎败。
- CAG-LSL-dCas9-SPH
品系全名：C57BL/6-Tg(CAG-LSL-dCas9-SPH)Smoc
目錄號：NM-TG-00025
品系描述：通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立CAG-LSL-dCas9-HA-SunTag-p65-HSF1-EGFP-WPRE-polyA轉(zhuǎn)基因小鼠。dCas9-SPH的表達受Cre重組酶調(diào)控蠢甲，與Cre工具鼠交配后僵刮，在Cre表達的細胞內(nèi)，可通過gRNA靶向并增強目的基因的表達。
參考文獻
Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83.
Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51.
Cheng AW, Wang H, Yang H, Shi L, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71.
Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, et al. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014 Oct 23;159(3):635-46.
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.
Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):339-50.
Zheng Y, Shen W, Zhang J, Yang B, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):447-454.
Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y妓笙，et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018 Jul 16. doi: 10.1038/s41592-018-0048-5.
Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446.
Kampmann M. CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.
原文：CRISPRi與CRISPRa的區(qū)別|如何對體內(nèi)內(nèi)源基因調(diào)控|南模生物 (modelorg.com)
