Article title：Transcriptomic and Metabolomic Analyses Provide Insights into the Upregulation of Fatty Acid and Phospholipid Metabolism in Tomato Fruit under Drought Stress

期刊：Agricultural and Food Chemistry

發(fā)表時(shí)間：2021

通訊作者：Tomiko Asakura

摘要

在這個(gè)研究中担平，干旱的脅迫條件促進(jìn)了番茄（Solanum lycopersicum）中脂肪酸的生物合成以及促進(jìn)了番茄果實(shí)中的脂肪酸（fatty acid）含量的積累给赞，并且在這個(gè)過程中一些由棕櫚酸（palmitic acid）和油酸（oleic acid）組成的磷脂（phospholipids）也發(fā)生了顯著的積累法梯，特別是在種子中速缨。此外拒秘，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中的肌醇也有所增加。在成熟的果實(shí)中碱蒙，β-丙氨酸和4-氨基丁酸等代謝調(diào)節(jié)因子水平升高琴儿。 這些結(jié)果都顯示這些組分都與干旱先攻有關(guān)，有助于提高干旱條件下的忍耐性以及可以提高后續(xù)的番茄果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值和健康益處茵休。

前言

番茄在全世界消耗量最大的蔬菜作物之一薪棒。各種各樣的西紅柿被廣泛的用于不同的食品加工過程。對(duì)于生吃的番茄（tomato fruits consumed raw）來說榕莺，顏色俐芯、口感和質(zhì)地等都是人們主要的關(guān)注點(diǎn)。近年來钉鸯，育種家一直通過雜交來培育新品種吧史，以提高消費(fèi)者在口味和質(zhì)地等方面的適口性（palatability）。除了培育具有理想性狀的家系外唠雕，還可以調(diào)整（tailored）栽培方法來提高營養(yǎng)價(jià)值和適口性贸营。栽培條例例如溫度、光照岩睁、肥沃度等都影響了果實(shí)的成分組成钞脂，在其他的一些蔬菜作物里，已經(jīng)有相關(guān)的研究證明一些栽培條件的改變會(huì)引起植物中代謝的改變捕儒，從而影響果實(shí)的糖分含量冰啃、氨基酸含量等。在干旱條件下刘莹，植物往往會(huì)減少能量的合成和抑制糖酵解（suppress glycolysis）來抵御水分的脅迫阎毅。人們對(duì)于干旱脅迫的反應(yīng)的研究主要集中在源器官例如根中，而在匯（sink）器官中的研究還非常的少点弯。

在遭受鹽脅迫或干旱脅迫的番茄植株中扇调，果實(shí)中次級(jí)代謝產(chǎn)物，如番茄紅素蒲拉、多酚和維生素的產(chǎn)生也會(huì)發(fā)生變化肃拜。這些化合物水平的變化已通過代謝組分析得到廣泛檢測。然而雌团，除了已經(jīng)關(guān)注的化合物外燃领，我們幾乎沒有關(guān)于哪些化合物在干旱脅迫下增加/減少的信息。 此外與提高抗寒性有關(guān)的生理活性成分的產(chǎn)生所涉及的代謝途徑仍然難以捉摸锦援。為了解決這個(gè)問題猛蔽，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和代謝組的聯(lián)合分析。果實(shí)中許多與合成相關(guān)的基因在綠色成熟期表達(dá)上調(diào)。為了調(diào)查果實(shí)在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)的基因表達(dá)和化合物生產(chǎn)之間的變化曼库，作者對(duì)成熟綠果進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析区岗，然后對(duì)成熟紅果進(jìn)行了代謝組分析。作者的研究提供了對(duì)干旱條件下番茄果實(shí)的味道質(zhì)量和功能成分的深入了解毁枯，并為蔬菜作物的生產(chǎn)和加工提供了更全面的考慮

from the standpoint 從這個(gè)角度來看????????????????????????????????????????????????????????? clay 粘土

soaked with 用...浸泡???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Liquid fertilizer 液體肥料

was sowed in a groove about 1 cm deep 播種在約1cm的槽中????????????????? dilute 稀釋

suspended 暫停???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? impurities 雜質(zhì)

agarose gel electrophoresis 瓊脂糖凝膠電泳????????????????????????????????????????? comprehensivelyexamine 全面檢查

desaturase 去飽和酶??????????????? ? ? ? ????? synthase 合成酶?????????? ? ? ?????????? reductase 還原酶

saturated/unsaturated 飽和/不飽和????????????????????????????????????????????????????? ?? ? jasmonate 茉莉酮酸酯

材料和方法

材料

種子獲取于National BioResource Project (NBRP) at the 筑波大學(xué)基因?qū)嶒?yàn)中心, 是在溫室（25 °C for 12 h during the day and 20 °C for 12 h at night）中培育慈缔。在后續(xù)的培養(yǎng)中，在開花后對(duì)照組每天都澆液體肥料水种玛，而處理組則每七天澆一次藐鹤。果實(shí)大約在開花后30天達(dá)到成熟的綠色階段，在開花后40天左右達(dá)到成熟的紅色階段赂韵。使用液氮取樣娱节，并立即放入-80℃保存。

DNA微列陣分析（ DNA Microarray Analysis）

技術(shù)認(rèn)識(shí)：關(guān)于微列陣芯片祭示、RNA-seq和轉(zhuǎn)錄組測序的關(guān)系肄满。

轉(zhuǎn)錄組代表存在于細(xì)胞中RNA的全部類型，包括mRNA质涛、rRNA稠歉、tRNA以及其它各種非編碼RNA等。微陣列（Microarray）和RNA-seq（RNA sequencing）是轉(zhuǎn)錄組分析中的兩種主要技術(shù)蹂窖。它們的主要區(qū)別在于轧抗，微陣列基于預(yù)先設(shè)計(jì)的標(biāo)記探針與目標(biāo)cDNA序列的雜交，而RNA-seq通過測序技術(shù)對(duì)cDNA鏈進(jìn)行直接測序瞬测。

微陣列取決于雜交探針，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)度定量基因相對(duì)表達(dá)水平纠炮。（首先從樣品中提取總RNA月趟，然后構(gòu)建cDNA文庫。將cDNA與預(yù)先設(shè)計(jì)的帶熒光標(biāo)記的DNA探針在固體表面（spot matrix）混合恢口，互補(bǔ)序列將與微陣列中的標(biāo)記探針雜交孝宗。通過檢測微陣列的探針熒光強(qiáng)度，這些探針代表了不同的基因耕肩，可獲得各基因的相對(duì)表達(dá)譜因妇。該技術(shù)的準(zhǔn)確性取決于所設(shè)計(jì)的探針，已知序列的堿基組成以及探針雜交的親和力猿诸，因此具有局限性）

RNA-seq是一種快速且高通量的方法婚被，不依賴于預(yù)先設(shè)計(jì)的探針或已知的序列堿基特征，因此具有較高的靈敏度和檢測新基因以及遺傳變異的能力梳虽。（首先提取總RNA并在純化后片段化處理址芯，然后構(gòu)建cDNA文庫，使用高通量測序的方法對(duì)cDNA進(jìn)行測序。獲得測序序列后比對(duì)到參考基因組上（或者從頭組裝轉(zhuǎn)錄本后再比對(duì)）谷炸，根據(jù)測序序列的覆蓋情況定量基因表達(dá)北专。理論上，如果測序深度足夠深旬陡，則可以覆蓋到所有基因拓颓，包括尚未發(fā)現(xiàn)的新基因，并能實(shí)現(xiàn)全長基因水平的定量描孟。并且RNA-seq本身是一種測序技術(shù)录粱，能獲得基因的堿基組成信息，因此除了用于定量基因表達(dá)外画拾，還可用于基因組結(jié)構(gòu)研究啥繁，這是微陣列芯片無法比擬的。但是高通量的方法存在一定的假陽性問題是不可忽視的）

作者在這個(gè)研究中是使用了基因芯片技術(shù)來測定基因的表達(dá)情況青抛，后續(xù)對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了注釋旗闽、差異分析、富集分析等蜜另。并且作者還進(jìn)行了熒光定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證适室。

代謝組分析

主要的步驟就是樣品準(zhǔn)備（使用的是凍存樣），對(duì)樣品處理后就進(jìn)行了衍生化（Derivatization）举瑰，然后介紹了GC-MS/MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）的一些參數(shù)捣辆，最后就是下機(jī)數(shù)據(jù)的分析介紹。

結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組分析

因?yàn)?b>不同mRNA水平有助于成熟果實(shí)中成分的生物合成此迅，所以作者全面的測定了番茄果實(shí)成熟的綠色時(shí)期分別在正常條件下（C）和在干旱脅迫條件（S）下的mRNA表達(dá)水平汽畴。差異表達(dá)基因的PCA結(jié)果顯示對(duì)照組和處理組表現(xiàn)出了很好的分組狀況。在這個(gè)基礎(chǔ)上耸序，作者進(jìn)行了GO富集分析忍些，并且比較了差異表達(dá)基因的表達(dá)水平。

1坎怪、通過GO富集分析對(duì)差異表達(dá)基因（DEGs）分類

通過分析罢坝，一共有31個(gè)terms被富集到，這31個(gè)terms被分為4個(gè)組搅窿，分別是細(xì)胞壁代謝（cell wall metabolism）嘁酿、脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）、果實(shí)成熟相關(guān)（fruit maturation related）和疾病響應(yīng)相關(guān)（disease response related）男应。之后作者是專門針對(duì)細(xì)胞壁代謝和脂肪酸代謝相關(guān)的差異基因進(jìn)行了比較（脅迫組和對(duì)照組）

2闹司、基因表達(dá)水平的比較

細(xì)胞壁相關(guān)的差異基因一共有18個(gè)，在脅迫組中有11個(gè)表達(dá)下調(diào)殉了，7個(gè)表達(dá)上調(diào)开仰。其中編碼與果膠生產(chǎn)相關(guān)的酶例如果膠酯酶（pectin esterase (PME)）和果膠裂解酶18（pectate lyase 18）出現(xiàn)了下調(diào)。其蛋白產(chǎn)物能合成肌醇的肌醇單磷酸酶1（myo-inositol monophosphatase 1（IMP））同樣也出現(xiàn)了下調(diào)。相反的是众弓，編碼催化相反的過程的酶的基因UDP-galactose:myo-inositol D-galactosyltransferase (Gols)出現(xiàn)了上調(diào)恩溅。此外，參與細(xì)胞壁木葡聚糖分子的移位和裂解的XTH6和XTH16出現(xiàn)了上調(diào)谓娃，而XTH3, XTH7, and XTH32出現(xiàn)了下調(diào)脚乡。作者同樣也通過熱圖對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)的差異基因做了這樣的比較。發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫的條件下滨达，跄坛恚基-[酰基載體蛋白]去飽和酶（Acyl-ACP desaturase）捡遍、3-氧跣慷基-[酰基載體蛋白]合酶I（FabB）画株、烯醇-[趿酒基載體蛋白]還原酶（FabI）發(fā)生了上調(diào)。此外谓传，編碼與飽和/不飽和脂肪酸生物合成的最后步驟相關(guān)的酶的基因油躜谙睿基酰基載體蛋白硫酯酶续挟、葉綠體（FatA）也發(fā)生了上調(diào)紧卒。相反的是與茉莉酮酸酯生物合成的基因脂氧合酶和烯氧合酶（AOS）發(fā)生了下調(diào)。

為了驗(yàn)證微列陣（基因芯片）數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性诗祸，作者對(duì)具有不同表達(dá)水平的基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證跑芳。結(jié)果表明在脂肪酸合成方面，編碼FabI, FabB, FatA贬媒，Acyl-ACP 去飽和酶的基因在脅迫組的表達(dá)水平要高于對(duì)照組聋亡。這些結(jié)果都支持脂肪酸合成會(huì)上調(diào)的預(yù)測。

在細(xì)胞壁代謝方面际乘，編碼PME的基因在干旱條件下要比對(duì)照條件下的表達(dá)水平下調(diào)0.1倍。這些結(jié)果都支持GO分析的結(jié)果漂佩，表明果膠的合成收到了抑制脖含。

代謝組分析

作者進(jìn)行了GC-MS分析來比較對(duì)照組和處理組在果實(shí)紅色成熟期組分之間的差異。通過PCA主成分分析投蝉，作者發(fā)現(xiàn)第一主成分為是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相關(guān)的糖和滲透脅迫誘導(dǎo)的化合物 养葵，例如葡萄糖醛酸-甲基-5TMS（2）、木糖-甲基-4TMS瘩缆、棕櫚酸TMS关拒、葡萄糖6-磷酸、甘露醇-6TMS和脯氨酸-2TMS。 第二主成分為氨基酸着绊，第三主成分為有機(jī)酸（organic acids）谐算。然后散點(diǎn)圖（Scatterplot）分析中，通過火山圖中對(duì)照組和處理組的比較归露，作者一共發(fā)現(xiàn)了142個(gè)化合物（fold change < 1.5）. 其中具有顯著差異的作者也做了論述洲脂。

代謝通路分析

在轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析的基礎(chǔ)上，作者進(jìn)行了果實(shí)在干旱條件下的代謝譜研究剧包。

轉(zhuǎn)錄組分析表明編碼果膠酯酶和果膠裂解酶的基因在脅迫組的表達(dá)水平要低于對(duì)照組恐锦。同樣的，代謝組分析也揭示半乳糖醛酸疆液、UDP葡萄糖醛酸一铅、葡萄糖醛酸鹽、抗壞血酸鹽和木糖的含量在脅迫組較低堕油，但 D-木果糖在該組的含量要高一些潘飘。因此轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，參與脂肪酸合成和代謝的編碼酶的基因表達(dá)均上調(diào)馍迄。在代謝組的結(jié)果中福也，硬脂酸與棕櫚酸出現(xiàn)了大幅上升，因?yàn)檫@兩種成分屬于長鏈脂肪酸DAG（1,2-diacyl-sn-glycerol）的成分攀圈，因此作者推測DAG是在成熟的紅色番茄中合成的暴凑。此外，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果也表明編碼催化DAG和磷脂酰膽堿的酶的基因PDCT1也出現(xiàn)了上調(diào)赘来。這些證據(jù)都表明干旱脅迫條件下脂肪酸合成增加導(dǎo)致DAG合成增加现喳，DAG隨后轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿。

在這種情況下犬辰，作者則比較了在成熟綠色番茄和成熟紅色番茄中磷脂酰膽堿嗦篱、雙棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和α-亞麻酸（18:3） 的變化，作者發(fā)現(xiàn)在這兩類番茄未成熟之前幌缝，果實(shí)中都存在磷脂酰膽堿和DPPC 灸促。然而當(dāng)番茄成熟的時(shí)候，對(duì)照組中這兩種物質(zhì)的表達(dá)水平都有所下降涵卵，而在脅迫組中浴栽，種子中表現(xiàn)出來比較高的表達(dá)量。在成熟的綠色番茄中轿偎，在對(duì)照組中典鸡，α-亞麻酸在種子附近表達(dá)，而在脅迫組中坏晦，α-亞麻酸在整個(gè)果實(shí)中表達(dá)萝玷。而在成熟的紅色番茄中嫁乘，卻是恰好相反的一個(gè)結(jié)果。

討論

1球碉、干旱脅迫增加了β-丙氨酸和脂肪酸代謝

β-丙氨酸通過草酰乙酸途徑轉(zhuǎn)化為輔酶A（CoA）和躜迅基載體蛋白（ACP）。CoA和ACP參與幾乎所有的代謝途徑汁尺，包括脂質(zhì)代謝法精、磷脂和三羧酸循環(huán)。在這個(gè)研究中作者觀察到脅迫組脂肪酸代謝的激活和磷脂的積累痴突，這可能與β-丙氨酸和草酰乙酸的增加密切相關(guān)搂蜓。

作者還觀察到與脂肪酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)顯著增加，脂肪酸增加辽装。有研究表明蘋果（Malus domestica）果實(shí)在長期冷藏期間脂肪酸合成上調(diào)帮碰，并發(fā)現(xiàn)促進(jìn)脂肪酸合成可維持膜穩(wěn)定性。同樣的在作者的研究中觀察到的脂質(zhì)代謝的上調(diào)也通過結(jié)構(gòu)重塑增強(qiáng)了番茄果實(shí)細(xì)胞膜拾积，使其能夠更好地保護(hù)種子免受干燥殉挽。在轉(zhuǎn)錄組分析中，PDCT1是干旱脅迫下表達(dá)較高的DEG之一拓巧。如成像MS所示斯碌，干旱脅迫導(dǎo)致成熟紅色果實(shí)種子周圍PO磷脂酰膽堿和DPPC的大量積累。因此肛度，作者推測合成的脂肪酸用于磷脂的合成傻唾，從而導(dǎo)致磷脂的增加。在脫水和滲透脅迫（如干旱）下承耿，在其他植物物種中也觀察到磷脂的結(jié)構(gòu)重塑冠骄。因此，在干旱脅迫下加袋，成熟紅色果實(shí)中的脂質(zhì)代謝上調(diào)凛辣，這促進(jìn)了番茄中磷脂的合成，以提高抗旱性职烧。

磷脂酰膽堿是植物質(zhì)體膜中合成甘油類的前體扁誓，這些甘油類化合物在動(dòng)物細(xì)胞中具有體外生理活性，例如抑制癌細(xì)胞生長蚀之、抑制血管生成和抗炎作用跋理。此外，抗腫瘤和抗炎作用已通過在皮膚和腹腔內(nèi)局部給藥甘油類藥物而得到證實(shí)恬总，因此由于干旱脅迫導(dǎo)致的磷脂酰膽堿的增加可能導(dǎo)致食用時(shí)番茄果實(shí)的健康促進(jìn)質(zhì)量的提高。

2肚邢、干旱脅迫增加α-亞油酸水平并上調(diào)Gols表達(dá)

實(shí)驗(yàn)證明脅迫組中的種子中α-亞麻酸出現(xiàn)了顯著積累壹堰，α-亞麻酸可以觸發(fā)植物在脅迫下的防御反應(yīng)拭卿。 先前的報(bào)道表明，添加α-亞麻酸可強(qiáng)烈誘導(dǎo)擬南芥中Gols的表達(dá)贱纠。因此在本實(shí)驗(yàn)中峻厚，α-亞麻酸在干旱脅迫下增加，隨后是Gols表達(dá)谆焊，這可能是上調(diào)的惠桃。

3、干旱脅迫改變了細(xì)胞壁成分的水平和與其代謝相關(guān)的基因的表達(dá)

肌醇合成的主要途徑涉及IMP27對(duì)肌醇-6-磷酸的催化作用 辖试。一般來說辜王，在干旱脅迫下，IMP基因會(huì)表達(dá)上調(diào)罐孝。然而在這個(gè)研究中呐馆，干旱脅迫組中IMP的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)，而葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸發(fā)生了下調(diào)莲兢。這表明番茄果實(shí)中肌醇是通過Gols介導(dǎo)的途徑合成的汹来。 在代謝組分析中，盡管肌醇增加改艇，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的量仍然減少收班。此外，果膠裂解酶18和PME1.9的水平下降谒兄。在干旱脅迫下摔桦，番茄果膠代謝發(fā)生了變化，但番茄果膠裂解酶18與干旱的關(guān)系尚未報(bào)道舵变。據(jù)報(bào)道酣溃，編碼果膠酯酶1（PE1）的PME1.9和PE2（PE1的一種亞型）的表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)變軟。這表明纪隙，干旱脅迫下PME1.9表達(dá)的減少抑制了番茄果實(shí)的軟化赊豌。 在番茄果實(shí)中，201個(gè)受干旱脅迫差異上調(diào)的基因包括編碼纖維素合成酶A催化亞基7和纖維素的基因CSLG2绵咱。研究表明碘饼，擬南芥的脅迫滲透耐受需要纖維素合成酶A和GALG2。AtCSLG2是番茄CSLG2的同系物悲伶，在干旱脅迫期間表現(xiàn)活躍艾恼，在干旱應(yīng)激下其表達(dá)被刺激達(dá)50倍。這些結(jié)果支持了我們的發(fā)現(xiàn)麸锉，即干旱脅迫導(dǎo)致番茄果實(shí)中編碼纖維素合成酶A和CSLG2的基因表達(dá)增加钠绍，但這些基因在果實(shí)中的功能仍需闡明。

4花沉、成熟綠色果實(shí)中乙烯和茉莉酸生物合成途徑下調(diào)

轉(zhuǎn)錄組分析表明柳爽，在番茄成熟綠色期干旱脅迫下媳握，茉莉酸生物合成途徑中編碼酶的基因表達(dá)下調(diào)。一般來說磷脯，在干旱脅迫條件下蛾找，擬南芥等植物中，茉莉酸是由膜脂主動(dòng)合成的赵誓，并誘導(dǎo)了脅迫反應(yīng)基因打毛。而在這個(gè)研究中的結(jié)果顯示，茉莉酸生物合成途徑的下調(diào)可能是成熟綠色果實(shí)特有的俩功。

至于乙烯幻枉，干旱脅迫下調(diào)了乙烯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，如ACS和ACO绑雄，它們催化乙烯生物合成的最終階段展辞，以及編碼主要乙烯反應(yīng)因子的ERF（ERF1、ERF1B万牺、ERF109罗珍、ERF5、Pti5和Pti6）脚粟。在葉和莖等源器官中覆旱，當(dāng)暴露于干旱脅迫時(shí)，茉莉酸和乙烯的水平增加核无，編碼參與其合成的酶的基因表達(dá)也增加扣唱。與此相反，在這個(gè)研究中团南，推測番茄果實(shí)中的茉莉酸和乙烯含量可能降低噪沙，因?yàn)榫幋a茉莉酸的基因和乙烯生物合成酶的表達(dá)降低。

5吐根、干旱脅迫增加了相容溶質(zhì)的水平?

植物通過合成調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)來應(yīng)對(duì)干旱脅迫正歼，這些是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓的相容溶質(zhì)。脯氨酸和4-氨基丁酸（GABA）均屬于相容溶質(zhì)拷橘，在干旱脅迫下局义，成熟綠色果實(shí)中脯氨酸含量增加3.8倍，GABA含量增加1.8倍（表3）冗疮。先前對(duì)不同番茄品種的研究表明萄唇，鹽和水分脅迫增加了番茄種子中脯氨酸和GABA的積累。 在動(dòng)物中术幔，GABA高度集中在大腦中另萤，起到抑制神經(jīng)傳遞的作用。攝入的影響包括降壓效應(yīng)诅挑、改善阿爾茨海默病仲墨、預(yù)防糖尿病和增強(qiáng)免疫力勾缭。這些定義表明，當(dāng)食用水果時(shí)目养，干旱脅迫可以提高水果的健康效益。 當(dāng)遭受干旱脅迫時(shí)毒嫡，植物會(huì)急劇改變新陳代謝癌蚁，以耐受干旱，并產(chǎn)生化合物兜畸，幫助它們應(yīng)對(duì)相關(guān)的氧化應(yīng)激努释。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下栽培的番茄可能比在正常條件下生長的番茄具有更高的生理調(diào)節(jié)功能 咬摇。