摘要

隨著對(duì)人類疾病的分子理解不斷加深和基因傳遞技術(shù)的不斷改進(jìn)，臨床基因治療取得了越來(lái)越多的成功。其中，基于腺相關(guān)病毒（AAV）的遞送載體已被證明是安全和有效的，甚至在最近的一個(gè)案例中獲得了監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)且叁。雖然病毒載體的特性限制了將這種療法擴(kuò)展到許多其他人類疾病，但通過新的工程和改進(jìn)AAV載體及其遺傳載體的方法秩伞，越來(lái)越多的障礙得以克服逞带，為提供改進(jìn)的治療選擇打開了新的可能性欺矫。

引言

目前全球有大約7,000種單基因遺傳疾病，給數(shù)百萬(wàn)人帶來(lái)了嚴(yán)重的個(gè)人和社會(huì)后果展氓，而其中絕大多數(shù)疾病目前還沒有有效的治療方法穆趴。然而，隨著下一代測(cè)序技術(shù)的快速進(jìn)展带饱，已經(jīng)成功鑒定出約50%的這些疾病對(duì)應(yīng)的基因毡代，而其余部分預(yù)計(jì)在未來(lái)十年內(nèi)也將被找到。與此同時(shí)勺疼，基因治療領(lǐng)域克服了許多安全和高效基因遞送的難題教寂，為一些單基因疾病提供了前所未有的治療機(jī)會(huì)。此外执庐，基因治療在一些復(fù)雜疾病中也顯示出成功的跡象酪耕，如心臟病、神經(jīng)退行性疾病轨淌、中風(fēng)和糖尿病等慢性疾病迂烁。將疾病遺傳學(xué)和病理學(xué)知識(shí)與有效的基因治療相結(jié)合，為單基因和復(fù)雜人類疾病開發(fā)出單次治療方案递鹉，有望徹底改變醫(yī)療保健的模式盟步。

截至目前，基因治療的成功主要得益于發(fā)現(xiàn)了幾種可用于改造成有效基因傳遞載體的病毒躏结，其中包括無(wú)致病性的腺相關(guān)病毒（AAV）（圖1）却盘。特別是使用AAV載體進(jìn)行的越來(lái)越多的I期至III期臨床試驗(yàn)取得了令人鼓舞的結(jié)果。例如媳拴，在家族性脂蛋白脂酶（LPL）缺乏癥的試驗(yàn)中黄橘，采用基于AAV1的載體編碼功能增強(qiáng)變體LPLS447X，導(dǎo)致持久的基因表達(dá)和蛋白活性屈溉，從而持續(xù)降低了胰腺炎的發(fā)病率塞关。基于這些結(jié)果和其良好的安全性子巾，這一產(chǎn)品名為Glybera（alipogene tiparvovec）在2012年獲得了歐洲聯(lián)盟的市場(chǎng)批準(zhǔn)帆赢，盡管是在“特殊情況”下（請(qǐng)參見EMEA網(wǎng)站，https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/glybera-epar-product-information_en.pdf）线梗。此為西方國(guó)家首個(gè)獲得批準(zhǔn)的基因治療產(chǎn)品椰于。AAV載體在其他單基因疾病中也顯示出安全性和有效性，包括先天性黑蒙癥2型缠导、無(wú)脈絡(luò)膜癥和血友病B等疾病。與此同時(shí)溉痢，AAV還被應(yīng)用于特發(fā)性疾病的治療僻造。例如憋他，通過給予攜帶SERCA2a基因的AAV1載體治療，改善了晚期心力衰竭患者的多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)髓削。因此竹挡，基因治療在孟德爾遺傳疾病和復(fù)雜疾病方面顯示出越來(lái)越多的潛力。

然而立膛，在基因治療領(lǐng)域中揪罕，有效傳遞遺傳物質(zhì)一直是一個(gè)重大挑戰(zhàn)（方框1），因?yàn)樵S多治療適應(yīng)癥的遞送需求與病毒載體的天然傳染特性不匹配宝泵。為了克服這些障礙好啰，已經(jīng)采用了一些創(chuàng)新的方法。例如儿奶，對(duì)AAV（腺相關(guān)病毒）外殼結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)不斷提高框往，促進(jìn)了對(duì)AAV外殼的合理設(shè)計(jì)，而AAV外殼庫(kù)的開發(fā)和篩選方法的發(fā)展則有助于有針對(duì)性的改進(jìn)AAV外殼闯捎。此外椰弊，雖然迄今為止基因治療在基因替代治療隱性遺傳疾病方面取得了主要成功，但隨著治療載荷的進(jìn)展瓤鼻，很快也可能實(shí)現(xiàn)對(duì)顯性遺傳疾病的治療秉版。

BOX 1 AAV基因傳遞和療效的挑戰(zhàn)

免疫相互作用
免疫系統(tǒng)在阻止外源核酸的傳遞方面是非常有效的，免疫系統(tǒng)對(duì)于外源核酸的傳遞非常有效茬祷，這給基因治療帶來(lái)了許多挑戰(zhàn)清焕。廣泛的自然AAV接觸導(dǎo)致大部分人群體內(nèi)存在中和AAV外殼抗體，存在于血液和其他體液中牲迫。此外耐朴，在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后，AAV外殼表位可能會(huì)在MHC I復(fù)合物上進(jìn)行交叉呈遞盹憎，導(dǎo)致特異性靶向外殼的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞消除被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞筛峭，進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)的喪失，正如早期血友病B臨床試驗(yàn)中觀察到的因子IX表達(dá)下降所示陪每。許多人CD4+和CD8+T細(xì)胞表位已經(jīng)被鑒定為針對(duì)AAV2和AAV8影晓，而MHC基因座是人類基因組中最多態(tài)性的之一，這使得設(shè)計(jì)出一種能夠逃避所有可能的MHC組合識(shí)別的AAV外殼變得困難檩禾。然而挂签，有可能通過工程手段設(shè)計(jì)出不容易被蛋白酶體或與抗原處理相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)處理的AAV外殼。

對(duì)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和趨化
針對(duì)系統(tǒng)性給予的病毒而言盼产，肝臟通常是默認(rèn)的目標(biāo)饵婆，但當(dāng)其他器官是預(yù)期的目標(biāo)時(shí)，這可能會(huì)構(gòu)成一個(gè)障礙戏售。此外侨核，一些組織中的內(nèi)皮細(xì)胞層草穆，特別是在血腦屏障內(nèi)，會(huì)形成物理屏障搓译，阻礙病毒進(jìn)入悲柱。當(dāng)病毒進(jìn)入某個(gè)器官時(shí)，它可能會(huì)面臨多個(gè)傳輸障礙些己，這會(huì)限制其對(duì)通常較大的組織體積進(jìn)行高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)豌鸡。這些傳輸障礙包括細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)部的障礙，以及細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)和連接方式段标。在這些障礙中涯冠，許多AAV變體可能會(huì)與特定分子相互作用，如肝素硫酸鹽怀樟，從而影響其在組織中的擴(kuò)散和傳輸能力功偿。

細(xì)胞屏障
一旦載體抵達(dá)目標(biāo)細(xì)胞表面朽缴，可能會(huì)缺乏與載體結(jié)合和內(nèi)化所需的主要和/或次要受體捡需。此外授帕，逃脫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)译打、逃脫蛋白酶體普舆、進(jìn)入細(xì)胞核以及載體解包裝等過程都代表著基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的障礙濒旦。

包裝容量
天然的腺相關(guān)病毒（adeno-associated viruses仪芒，AAV）具有一個(gè)單鏈的4.7 kb DNA 基因組蛮粮。已經(jīng)證明穆咐，基于AAV的基因傳遞載體能夠以接近天然滴度和感染能力包裝長(zhǎng)達(dá)約5 kb的基因組颤诀，超過這個(gè)長(zhǎng)度，包裝效率顯著下降对湃，且會(huì)導(dǎo)致5'端截短的基因組被封裝崖叫。

這篇進(jìn)展文章重點(diǎn)介紹了載體工程領(lǐng)域的最新創(chuàng)新，特別是對(duì)腺相關(guān)病毒（AAV）變體的合理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化拍柒，以及修改遺傳載荷的新方法心傀。我們討論了幾種成功應(yīng)用的載體工程策略，這些策略創(chuàng)建了新型AAV變體拆讯，旨在克服AAV介導(dǎo)的基因傳遞面臨的一些當(dāng)前挑戰(zhàn)脂男，這些策略中尤其是針對(duì)殼蛋白工程的定向進(jìn)化方法。

改造傳遞系統(tǒng)

在利用AAV進(jìn)行基因傳遞時(shí)面臨的挑戰(zhàn)（見方框1）源于一個(gè)簡(jiǎn)單的事實(shí)种呐，即自然病毒感染成功所需的特性與大多數(shù)醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需的特性是不同的宰翅，因?yàn)椴《静⒎菫楹笳叨M(jìn)化。然而爽室，通過載體工程汁讼，我們可以解放使病毒擺脫自然進(jìn)化的限制，從而獲得新的、在生物醫(yī)學(xué)上具有價(jià)值的特征嘿架。這種載體工程的發(fā)展可以分為兩個(gè)主要方向：合理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化卜录。

AAV變體的合理設(shè)計(jì)

在某些情況下，對(duì)遞送機(jī)制的了解以及AAV結(jié)構(gòu)分析可以促進(jìn)載體的改進(jìn)眶明。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)筐高，對(duì)AAV顆粒中的衣殼酪氨酸殘基進(jìn)行磷酸化會(huì)導(dǎo)致其被泛素化并促使其通過蛋白酶體降解搜囱。這一發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了通過定向突變將酪氨酸突變?yōu)楸奖彼岬姆椒▉?lái)改進(jìn)載體。在一項(xiàng)研究中柑土，這些改進(jìn)的載體在體外的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平提高了10倍蜀肘，并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高達(dá)30倍的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。最近稽屏，利用這種方法成功地改造出一種新型AAV2(Tyr-Phe)突變型衣殼扮宠，該突變型衣殼具有潛在的降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的特性，而這正是臨床應(yīng)用AAV介導(dǎo)的基因治療面臨的一個(gè)主要限制（參見方框1）狐榔。具體而言坛增，通過將酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔芯咳藛T發(fā)現(xiàn)這些突變體在體外可實(shí)現(xiàn)高達(dá)10倍的轉(zhuǎn)基因表達(dá)薄腻，在體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)高達(dá)30倍的轉(zhuǎn)基因表達(dá)收捣。這是因?yàn)檫@些酪氨酸突變影響了衣殼的蛋白酶體降解過程，從而可能降低了衣殼抗原通過MHC I類呈遞的過程庵楷，而這個(gè)過程通常始于細(xì)胞質(zhì)中蛋白的蛋白酶體降解罢艾。

針對(duì)預(yù)先存在的中和抗體（參見方框1），也已經(jīng)采取了合理設(shè)計(jì)的方法來(lái)解決這些挑戰(zhàn)尽纽。絕大多數(shù)人類已經(jīng)自然地接觸過AAV咐蚯，并且自然AAV變體和血清型之間存在相當(dāng)大的序列相似性。因此弄贿，相當(dāng)一部分人類攜帶有中和抗體春锋，這些抗體極大地限制了許多自然載體（AAV2：72%、AAV1：67%挎春、AAV9：47%看疙、AAV6：46%、AAV5：40%和AAV8：38%）的基因遞送能力直奋。在大多數(shù)臨床研究中能庆，可以排除具有中和抗體的患者，解決這個(gè)問題脚线，但需要進(jìn)一步改進(jìn)以擴(kuò)大能從該療法中獲益的患者人群搁胆。為了發(fā)現(xiàn)和突變與抗血清型抗體結(jié)合有關(guān)的表位，采用了多種策略， 已經(jīng)為幾種抗體分析了負(fù)責(zé)中和抗體與AAV外殼結(jié)合的線性和構(gòu)象表位渠旁。隨后攀例，Lochrie等人使用基于計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)構(gòu)分析方法，在AAV2表面中確定了與小鼠IgG2a抗體結(jié)合的可能結(jié)合位點(diǎn)顾腊，并對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了廣泛的定點(diǎn)突變粤铭，以開發(fā)出在體外對(duì)小鼠和人抗體中具有降低中和作用的變體。Mingozzi等人最近采用的另一種方法是生成基于AAV2的空殼顆粒杂靶，該顆粒發(fā)生了突變梆惯，使AAV與初級(jí)細(xì)胞受體的結(jié)合消失。當(dāng)與攜帶治療基因的重組載體混合時(shí)吗垮，這些空殼顆炼饴穑可以作為誘餌結(jié)合低至中等水平的中和抗體，從而增強(qiáng)小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中共同注射的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力烁登，使其達(dá)到與未接觸中和抗體的動(dòng)物相等或更高的水平怯屉。

在另一個(gè)合理設(shè)計(jì)的例子中，將高親和力配體納入AAV外殼中可以使其與其他細(xì)胞表面受體結(jié)合饵沧，從而限制或重定向病毒顆粒锨络。在最近的一項(xiàng)臨床前研究中，Münch等人在AAV2外殼的VP2區(qū)域的N端插入了針對(duì)HER2受體的設(shè)計(jì)蛋白重復(fù)蛋白（圖1）狼牺，從而使載體在體外增加對(duì)HER2受體過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的特異性約30倍足删，在體內(nèi)增加約20倍。此外锁右，通過對(duì)受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域的了解和結(jié)構(gòu)比對(duì)失受，可以實(shí)現(xiàn)病毒靶向性的改變。例如咏瑟，Shen等人利用定點(diǎn)誘變技術(shù)將負(fù)責(zé)AAV9結(jié)合的氨基酸與AAV2外殼中相應(yīng)位點(diǎn)的半乳糖殘基結(jié)合在一起拂到。設(shè)計(jì)出雙糖結(jié)合的AAV載體，能夠同時(shí)利用肝素硫酸鹽和半乳糖受體進(jìn)入細(xì)胞码泞。由于具備這種雙重受體結(jié)合能力兄旬，該載體在肝臟中的感染能力顯著高于AAV2，并且比AAV9對(duì)肝臟具有更高的特異性余寥。

然而领铐，在許多情況下，對(duì)于特定基因遞送問題宋舷，對(duì)病毒結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解還不足以實(shí)現(xiàn)有目的性的設(shè)計(jì)AAV復(fù)雜病毒顆粒绪撵。為了解決這一困境，近年來(lái)出現(xiàn)了一種方法祝蝠，即定向進(jìn)化音诈，它模擬了自然進(jìn)化的過程幻碱。

AAV變體的定向進(jìn)化

定向進(jìn)化策略利用遺傳多樣性和選擇過程，通過逐步積累有益突變來(lái)改善生物分子的功能（Box 2细溅，圖2）褥傍。在該過程中，野生型AAV capsid基因通過多種方法進(jìn)行多樣化喇聊，形成大規(guī)模的基因庫(kù)恍风，并將其包裝成病毒顆粒的庫(kù)，然后通過選擇壓力篩選出能夠克服基因遞送障礙的新變體（Box 2）誓篱。重要的是邻耕，定向進(jìn)化這種方法不要求了解基因遞送問題的具體機(jī)理，因此可以加快改進(jìn)載體的開發(fā)速度燕鸽。

BOX 2 衣殼改造中的定向進(jìn)化原理

文庫(kù)構(gòu)建方法

易錯(cuò) PCR
為了生成基因庫(kù)，常用的方法是低保真度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）啼辣，也稱為易錯(cuò)PCR啊研。易錯(cuò)PCR可以在AAV cap ORF中引入隨機(jī)的點(diǎn)突變，其引入突變的速率可以事先確定和調(diào)整鸥拧。這一方法可以對(duì)AAV的外殼蛋白進(jìn)行一些變化党远，盡管引入的點(diǎn)突變數(shù)量相對(duì)較少。此外富弦，易錯(cuò)PCR還可以與其他突變策略結(jié)合使用沟娱，以進(jìn)一步優(yōu)化所需的變體。

嵌合衣殼
通過體內(nèi)病毒重組技術(shù)或更常見的DNA重組腕柜，可以產(chǎn)生AAV外殼基因的隨機(jī)嵌合體济似，從而生成由多種血清型組成的嵌合體外殼基因庫(kù)。這些“繁育出的”殼體可以以新穎的方式結(jié)合其親本屬性盏缤。然而砰蠢，許多變異殼體可能無(wú)法進(jìn)行包裝，這大大減少了庫(kù)中的多樣性唉铜。

隨機(jī)肽段插入
隨機(jī)肽序列可以插入到病毒殼體的特定位點(diǎn)台舱，例如AAV2殼體的肝素結(jié)合域以及通過將簡(jiǎn)并寡核苷酸連接到殼體開放閱讀框中的AAV。隨機(jī)肽的插入可能會(huì)將AAV載體對(duì)新的細(xì)胞表面受體的結(jié)合轉(zhuǎn)移潭流。相反竞惋，可以通過轉(zhuǎn)座子突變將特定的肽編碼序列插入到AAV2殼體開放閱讀框的隨機(jī)位置。

表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化
多樣性也可以集中在AAV殼體的多個(gè)高度可變區(qū)域灰嫉，這些區(qū)域位于表面暴露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上拆宛。例如，我們生成了一種稱為“環(huán)交換”的肽序列庫(kù)讼撒。在這個(gè)過程中胰挑，我們將AAV2的四個(gè)表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)替換蔓罚。這些替換的肽序列是通過生物信息學(xué)設(shè)計(jì)的，它基于自然AAV血清型和變種中每個(gè)氨基酸位置的保守性級(jí)別瞻颂。與隨機(jī)肽插入庫(kù)類似豺谈，只有殼體的一小部分發(fā)生了突變，但這種方法可以與其他突變策略配對(duì)贡这，從而修改整個(gè)殼體茬末。

選擇

親和力柱分選
我們可以利用親和柱來(lái)篩選出具有增強(qiáng)或降低與細(xì)胞表面蛋白結(jié)合親和力的AAV變體，這種篩選過程通過洗脫不同部分以獲取有改變的結(jié)合親和力的變體盖矫。然而丽惭，盡管這種方式能夠迅速挑選出具有新型受體結(jié)合親和力或特異性的AAV變體，但它并未涵蓋到感染路徑中其他重要的環(huán)節(jié)辈双，如細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)责掏。

體外細(xì)胞培養(yǎng)模型
當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)模型能夠模擬體內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵方面，如抗殼體抗體的結(jié)合或氣道上皮結(jié)構(gòu)和極化時(shí)湃望，使用從組織樣本中分離出的原代細(xì)胞或模擬人體內(nèi)細(xì)胞行為的永生細(xì)胞系進(jìn)行體外選擇策略换衬，可以有效地創(chuàng)造結(jié)合效率增強(qiáng)以及特異性增強(qiáng)的AAV變體。因此证芭，體外選擇已經(jīng)產(chǎn)生了針對(duì)一些細(xì)胞類型的改良AAV變體的開發(fā)瞳浦，包括人類氣道上皮，人類膠質(zhì)細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞废士。然而叫潦，這種選擇策略并不能準(zhǔn)確模擬完整的體內(nèi)環(huán)境，例如免疫交互官硝，器官生物分布矗蕊，組織運(yùn)輸障礙，以及組織內(nèi)其他細(xì)胞類型的存在氢架。

體內(nèi)模型
為了更準(zhǔn)確地捕捉臨床基因治療環(huán)境拔妥，可以直接在動(dòng)物模型中進(jìn)行選擇。AAV庫(kù)可以通過各種給藥途徑進(jìn)行給藥达箍，包括靜脈注射没龙，玻璃體內(nèi)給藥，或直接進(jìn)行腦內(nèi)注射缎玫。然后收集感興趣的組織或細(xì)胞類型硬纤，進(jìn)而篩選成功感染該目標(biāo)的AAV變體。一個(gè)挑戰(zhàn)是赃磨，產(chǎn)生的變體能夠提高用于所選的動(dòng)物的感染性筝家，但這并不一定能提高人類細(xì)胞的感染性×诨裕可以利用人類異種移植模型來(lái)篩選能感染到移植人類細(xì)胞的AAV變體溪王。然而腮鞍，這種優(yōu)勢(shì)同樣面臨挑戰(zhàn)。首先莹菱，由于宿主免疫功能缺失移国，所使用的模型并未包含完整的免疫系統(tǒng)。其次道伟，在非人靈長(zhǎng)類或人類的環(huán)境中迹缀，對(duì)特定人類目標(biāo)細(xì)胞的特異性是未知的。

Genome recovery

腺病毒介導(dǎo)復(fù)制
為成功的病毒基因組提供在基因庫(kù)中增加頻率的機(jī)會(huì)蜜徽，這是自然選擇的內(nèi)在特性祝懂。在多種體外選擇實(shí)驗(yàn)中，腺病毒被用作輔助病毒拘鞋，用以擴(kuò)增已進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞核內(nèi)的AAV載體砚蓬。人腺病毒的挽救方法也被用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以擴(kuò)增已感染人肝細(xì)胞而非小鼠肝細(xì)胞的載體盆色。這種策略在目標(biāo)細(xì)胞對(duì)腺病毒超感染開放且易接觸時(shí)灰蛙，會(huì)非常有效。

PCR擴(kuò)增
盡管此方法存在風(fēng)險(xiǎn)傅事，可能僅篩選出那些局部存在于特定細(xì)胞或組織中而并未真正有效感染它們的基因組，但PCR在許多體內(nèi)選擇研究中峡扩，成功地實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型AAV變體的擴(kuò)增和回收蹭越。當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞難以接觸或?qū)ο俨《靖腥静幻舾校蛘弋?dāng)使用具有復(fù)制能力的載體庫(kù)可能引發(fā)生物安全問題時(shí)教届，這種策略顯得非常適合响鹃。

定向進(jìn)化首次被應(yīng)用于解決中和抗體問題，幾項(xiàng)有前景的研究報(bào)道了成功的例子案训，例如买置，產(chǎn)生出的AAV2變體可以在體內(nèi)外承受比野生型AAV2顯著更高的中和抗體水平。最近的研究涉及使用多個(gè)不同的人類抗-AAV抗體庫(kù)作為選擇壓力進(jìn)行多輪定向進(jìn)化强霎，也產(chǎn)生出了在體內(nèi)外都能增強(qiáng)抗體逃避的新變體忿项。具體來(lái)說，我們通過對(duì)幾個(gè)對(duì)抗體結(jié)合起關(guān)鍵作用的氨基酸進(jìn)行飽和突變(saturation mutagenesis)或者進(jìn)行DNA重組城舞，創(chuàng)建了AAV的變體轩触，與AAV1（與AAV2相比為35倍）相比，需要高達(dá)20倍的體外濃度的人抗體庫(kù)來(lái)中和家夺。此外脱柱，這些變體的抗體中和特性也促使了體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強(qiáng)。具體來(lái)說拉馋，在接受了人源抗體的被動(dòng)免疫的小鼠體內(nèi)榨为，這些變體的肝臟惨好、心臟和肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)率比AAV2顯著提高。

另一方面随闺，人們已經(jīng)通過定向進(jìn)化生成了AAV的突變型囊殼蛋白日川，使其能更有效和特異性地感染原本不易被感染的細(xì)胞類型。例如板壮，工程師們已經(jīng)成功地改造了載體逗鸣，在體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境中使人源氣道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提升了100倍，神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提升了50倍绰精，人類多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提升了3倍撒璧。更進(jìn)一步，定向進(jìn)化已越來(lái)越多地應(yīng)用于體內(nèi)模型笨使，尤其是在體外培養(yǎng)不能充分模擬真實(shí)情況的場(chǎng)合卿樱，比如系統(tǒng)性基因傳遞或者是通過復(fù)雜組織進(jìn)行載體傳輸。Yang等人針對(duì)小鼠肌肉的更高效感染進(jìn)行了體內(nèi)的生物篩選硫椰，結(jié)果生成的一種嵌合變異型外殼在心臟的感染效率與AAV9幾乎相等繁调，但在肝臟的定位上明顯減少，這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著意義靶草。此外蹄胰，Gray等人還分離出一種AAV8變體，這種變體能夠穿透由于癲癇引發(fā)的血腦屏障損傷奕翔，進(jìn)入大腦的某些區(qū)域裕寨。更近期，Lisowski等人采用了一種涉及免疫缺陷小鼠的模型派继，這些小鼠攜帶人類肝細(xì)胞異種移植物宾袜，以更好地模擬體內(nèi)人類肝細(xì)胞感染。在給予了一個(gè)嵌合AAV庫(kù)后驾窟，他們添加了人類腺病毒（具有對(duì)人類細(xì)胞的趨向性）來(lái)誘導(dǎo)所需AAV變體的復(fù)制庆猫，從而產(chǎn)生能夠有效且選擇性地進(jìn)行人類肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的AAV變體。未來(lái)的研究可能會(huì)將這些研究擴(kuò)展到大型動(dòng)物模型中绅络，尤其是非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物月培。

基因治療的臨床應(yīng)用也面臨著病毒感染的組織傳輸障礙這一關(guān)鍵限制（參見圖1）。舉例來(lái)說恩急，在視網(wǎng)膜疾病中最受影響的細(xì)胞 —— 視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 —— 都隱藏在數(shù)百微米厚的密集組織之后节视。視網(wǎng)膜下注射與玻璃體腔內(nèi)注射相比存在手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，并且無(wú)法感染整個(gè)視網(wǎng)膜假栓。因此寻行，Klimczak等人通過工程技術(shù)研發(fā)了一種AAV變體，該變體通過玻璃體腔內(nèi)注射匾荆，可以高度特異性（94%）且高效地感染遍布全視網(wǎng)膜的Müller細(xì)胞拌蜘。在一種視網(wǎng)膜色素變性的大鼠模型中杆烁，使用這種工程化的AAV變體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞，從而廣泛地表達(dá)了一種神經(jīng)保護(hù)因子简卧，減緩了視網(wǎng)膜退化的速度兔魂。在近期的一項(xiàng)研究中，Dalkara等研究者運(yùn)用體內(nèi)定向進(jìn)化技術(shù)開發(fā)出一種AAV举娩，該AAV能夠在玻璃體腔內(nèi)注射后析校，將遺傳物質(zhì)運(yùn)輸至視網(wǎng)膜并直接感染感光細(xì)胞。這種經(jīng)過改造的變種在小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)铜涉，能在感光細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大幅度的基因表達(dá)增加智玻，進(jìn)而成功救治了患有X-linked retinoschisis和Leber's congenital amaurosis type的小鼠模型。

通過在各種體內(nèi)外系統(tǒng)中的成功運(yùn)用芙代，定向進(jìn)化已展示出克服廣泛基因傳遞挑戰(zhàn)的強(qiáng)大能力吊奢。未來(lái)的研究可能將更深入地融合對(duì)衣殼結(jié)構(gòu)的理解，以及DNA合成和測(cè)序的先進(jìn)技術(shù)纹烹，進(jìn)一步提升這一技術(shù)平臺(tái)的性能页滚。除了開發(fā)改進(jìn)的載體外，對(duì)于遺傳負(fù)載的深入研究也將進(jìn)一步拓寬基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域铺呵。

工程遺傳有效載荷

AAV介導(dǎo)的基因療法需要面對(duì)兩個(gè)額外的挑戰(zhàn)：一是治療常染色體顯性遺傳疾病裹驰，這種情況下需要去除而不是增加一個(gè)等位基因；二是在某些情況下片挂，AAV的基因負(fù)載能力（4.7 kb）有限幻林。我們可以通過改變遺傳負(fù)載，而非病毒殼體宴卖，來(lái)解決這些問題滋将。特別是邻悬，隨著特異性序列內(nèi)切酶（包括ZFNs症昏、TALENs，以及CRISPR-Cas系統(tǒng)）的不斷涌現(xiàn)父丰，我們可能找到解決這些挑戰(zhàn)的創(chuàng)新辦法肝谭。內(nèi)源基因修復(fù)一直是基因療法的重要目標(biāo)。序列特異性的內(nèi)切酶可以提高有缺陷的等位基因與供體DNA之間的同源重組效率蛾扇。例如攘烛，在一種血友病B的小鼠模型中，Li等人使用攜帶針對(duì)F9基因（編碼凝血因子IX）的ZFN的AAV8載體來(lái)引發(fā)基因組中的雙鏈斷裂镀首，以此促進(jìn)與同時(shí)輸入的坟漱、無(wú)啟動(dòng)子的凝血因子IX cDNA片段進(jìn)行同源重組。實(shí)際上更哄，這樣產(chǎn)生的基因修復(fù)足以改善血液凝固時(shí)間芋齿，這提出了一種可能性：即使是對(duì)AAV來(lái)說過大的cDNA片段也可能被用于修復(fù)如肌萎縮蛋白腥寇、CFTR、CEP290觅捆、ABCA4赦役、MYO7A、USH2A和F8（編碼凝血因子VIII）這些大型內(nèi)源基因中的局部突變栅炒。此外掂摔，盡管RNA干擾已經(jīng)應(yīng)用于特異性敲減致病等位基因，但通過AAV投遞的目標(biāo)DNA結(jié)合蛋白或核酸酶可能實(shí)現(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)錄抑制赢赊，甚至徹底地敲除這些致病基因乙漓。雖然我們還需要進(jìn)行更多的研究，以揭示這種方法對(duì)非目標(biāo)位點(diǎn)可能產(chǎn)生的基因毒性域携，但是結(jié)合使用創(chuàng)新的載體和有效的載荷簇秒，將有可能進(jìn)一步擴(kuò)大基因治療的應(yīng)用范圍。

結(jié)論

AAV對(duì)易接觸組織的臨床投遞已經(jīng)成功地治療了一些隱性單基因疾病秀鞭，這為該領(lǐng)域注入了巨大的動(dòng)力。然而锋边，我們?nèi)孕枰鎸?duì)藥物投遞和藥物載荷的巨大挑戰(zhàn)皱坛。幸運(yùn)的是，像許多生物分子一樣豆巨，病毒具有極高的可塑性剩辟。通過工程技術(shù)和進(jìn)化策略，我們可以設(shè)計(jì)和定制具有針對(duì)性治療需求特性的載體往扔，這可能會(huì)將更多的治療目標(biāo)納入AAV的覆蓋范圍贩猎。此外，新的荷載開發(fā)萍膛，特別是位點(diǎn)特異性DNA內(nèi)切酶吭服，為我們提供了進(jìn)行基因修復(fù)甚至治療顯性遺傳疾病的可能性。隨著人類疾病生物學(xué)蝗罗、AAV病毒學(xué)艇棕、工程技術(shù)和治療荷載的最新進(jìn)展，我們有望將臨床成功擴(kuò)展到更多的單基因和復(fù)雜疾病串塑。