基因療法是治療遺傳性疾病的一種極具潛力的方法喻鳄，在體內(nèi)進(jìn)行基因替代治療已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中引人注目的概念之一憨闰。腺相關(guān)病毒（AAV）載體被廣泛應(yīng)用于此類治療中询兴，并在多種動(dòng)物模型中顯示出治療效果。雖然將這一成果成功轉(zhuǎn)化為臨床治療起初進(jìn)展緩慢起趾，但如今已經(jīng)在遺傳性視網(wǎng)膜疾病和血友病B患者中實(shí)現(xiàn)了相關(guān)基因的長(zhǎng)期治療水平的持續(xù)表達(dá)。最近的研究結(jié)果令人興奮警儒，為治療其他疾病帶來(lái)了希望训裆。然而，正如我們?cè)谶@里所討論的蜀铲，AAV基因療法的前景和挑戰(zhàn)在很大程度上取決于治療的目標(biāo)組織和具體疾病的特點(diǎn)边琉。

引言

遺傳性疾病在疾病負(fù)擔(dān)中占據(jù)重要地位，兒童醫(yī)院的住院人數(shù)中高達(dá)70%是由遺傳性疾病引起的记劝，成人醫(yī)院的住院人數(shù)中也有10%與此類疾病相關(guān)变姨。此外，許多常見(jiàn)的遺傳性疾病厌丑，如地中海貧血定欧、囊性纖維化和鐮狀細(xì)胞病，除了支持性護(hù)理外怒竿，仍然缺乏有效的治療方法砍鸠。人類基因組計(jì)劃最初的預(yù)期目標(biāo)之一是通過(guò)找出導(dǎo)致這些疾病的基因，從而促進(jìn)遺傳性疾病的更好治療耕驰。而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)最直接的方法就是開(kāi)發(fā)基因治療技術(shù)爷辱。基因治療的臨床試驗(yàn)始于20年前朦肘，近年來(lái)成功治療人類遺傳性疾病的報(bào)道逐漸增多饭弓。事實(shí)上，已經(jīng)有首個(gè)基因治療藥物針對(duì)遺傳性疾病提交了許可申請(qǐng)媒抠，為這一領(lǐng)域帶來(lái)了新的希望弟断。

目前，通過(guò)基因療法治療遺傳病的大多數(shù)策略都圍繞著兩種類型的載體：慢病毒用于將基因轉(zhuǎn)移到造血和其他干細(xì)胞中领舰，腺相關(guān)病毒（AAV）用于將基因轉(zhuǎn)移到載體具有滋養(yǎng)作用的后生組織中夫嗓。目前迟螺，治療遺傳疾病的基因治療策略主要集中在兩種類型的載體上：lentivirus（慢病毒）用于體外基因轉(zhuǎn)移，針對(duì)造血干細(xì)胞和其他干細(xì)胞舍咖；adeno-associated virus（腺相關(guān)病毒矩父，AAV）用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，針對(duì)對(duì)該載體具有親和性的有絲分裂后組織（postmitotic tissues）排霉。臨床經(jīng)驗(yàn)表明窍株，這兩種不同方法的毒性情況是不同的，與插入突變有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)是慢病毒（和其他整合）載體的主要安全問(wèn)題攻柠，而限制療效的免疫反應(yīng)是使用AAV載體進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的主要障礙（BOX 1）球订。在此，我們重點(diǎn)介紹了利用AAV進(jìn)行遺傳病體內(nèi)基因遞送的最新進(jìn)展瑰钮。 雖然其他病毒也被用于這種類型的基因治療（框2)冒滩，但迄今為止最有希望的結(jié)果是使用AAV（表1）； 近年來(lái)浪谴，AAV在先天性失明和血友病等疾病中的應(yīng)用取得了令人振奮的進(jìn)展开睡，這些結(jié)果使基因治療更接近臨床應(yīng)用。

BOX 1?基因治療的潛在并發(fā)癥

盡管基因治療在小型和大型動(dòng)物模型中取得了顯著的成功苟耻，但一系列問(wèn)題限制了其在人類中成功應(yīng)用的范圍篇恒。在過(guò)去的十年中的臨床研究中，已經(jīng)確定了幾個(gè)主要的基因治療障礙凶杖，如下所列胁艰。通常情況下，針對(duì)每種特定的載體智蝠、轉(zhuǎn)基因和目標(biāo)組織組合腾么，可能會(huì)出現(xiàn)一到兩個(gè)主要問(wèn)題，這些問(wèn)題成為臨床應(yīng)用中的主要障礙杈湾。

基因沉默

基因沉默可能是由于啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)喪失哮翘。在一項(xiàng)針對(duì)X連鎖慢性肉芽腫疾病的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因遞送的臨床研究中，首次記錄到了基因沉默現(xiàn)象毛秘。其中饭寺，一個(gè)最初從治療中受益的患者最終因疾病本身的并發(fā)癥而去世。在患者去世時(shí)叫挟，研究顯示60%的粒細(xì)胞攜帶治療基因艰匙，但只有不到10%的粒細(xì)胞表達(dá)該基因。

插入突變

這是由于治療載體基因組在宿主DNA中的隨機(jī)整合所導(dǎo)致的結(jié)果抹恳。首次在針對(duì)X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的臨床研究中報(bào)告了該現(xiàn)象员凝，其中載體基因組在LIM domain only 2 (LMO2) 原癌基因中的整合導(dǎo)致了惡性腫瘤。在以非整合性載體（如腺相關(guān)病毒-AAV）為主要載體的臨床基因轉(zhuǎn)移研究中奋献，沒(méi)有報(bào)道載體引發(fā)的惡性腫瘤健霹。盡管小鼠的臨床前研究表明AAV載體可能在宿主基因組中整合旺上，但整合介導(dǎo)的突變風(fēng)險(xiǎn)似乎很小。

表型毒性

Phenotoxicity可以由捐贈(zèng)基因的過(guò)度表達(dá)或異位表達(dá)引起糖埋。關(guān)于基因遞送可能存在的這種風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道主要限于臨床前研究宣吱。例如，格林姆（Grimm）等人的研究顯示瞳别，在使用AAV載體過(guò)度表達(dá)短發(fā)夾RNA時(shí)征候，小鼠會(huì)出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)。

免疫毒性

這指的是對(duì)載體或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的有害免疫反應(yīng)祟敛。一些臨床研究中觀察到針對(duì)AAV衣殼抗原的T細(xì)胞活化疤坝，其中部分研究發(fā)現(xiàn)這種免疫反應(yīng)與治療效果的減弱相關(guān)。在動(dòng)物模型和最近的肌萎縮性侯漢氏癥AAV基因遞送的臨床研究中馆铁，也發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物引發(fā)的免疫反應(yīng)跑揉。

Horizontal transmission of the donated DNA

在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移后，載體釋放的風(fēng)險(xiǎn)與給藥后的時(shí)間和給藥的載體劑量成正比埠巨。使用AAV進(jìn)行的人體研究表明畔裕，在系統(tǒng)性載體給藥后，載體可以在體液（如血清乖订、尿液和精液）中存在數(shù)周，但之后會(huì)消失具练。臨床前研究表明乍构，非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物體液中釋放的載體在72小時(shí)后不再具有傳染性。

Vertical transmission

這指的是不經(jīng)意地將捐贈(zèng)的DNA傳遞給生殖細(xì)胞扛点。人體內(nèi)給予AAV載體后哥遮，最初對(duì)生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起了一些擔(dān)憂。在血友病B犬的臨床前研究中陵究，并沒(méi)有預(yù)測(cè)到會(huì)發(fā)生生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)眠饮，但通過(guò)兔模型進(jìn)行的研究解決了這些擔(dān)憂，結(jié)果顯示幾種不同血清型的AAV并不通過(guò)雄性配子傳遞铜邮。

BOX 2 用于遺傳疾病的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的基因遞送載體

腺相關(guān)病毒載體

在基因治療遺傳性疾病的臨床研究中仪召，廣泛采用了腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）載體。這些載體是通過(guò)改造細(xì)小病毒科中的一種病毒而得到的松蒜，作為基因傳遞工具扔茅，具有許多優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)。這些載體對(duì)于一些非增殖秸苗、壽命較長(zhǎng)的細(xì)胞類型具有親和性召娜，因此即使沒(méi)有整合到宿主基因組中，也能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因表達(dá)惊楼。此外玖瘸，野生型AAV感染不會(huì)引發(fā)已知疾病的發(fā)生秸讹。

重組病毒由二十面體的病毒外殼組成，它在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下包裹著相關(guān)的治療基因雅倒。重組病毒顆粒的直徑約為20-25納米璃诀。野生型病毒的基因組有4,675個(gè)核苷酸，重組病毒顆镣投希可以包裝高達(dá)約5 kb的DNA序列文虏。野生型病毒在自然狀態(tài)下無(wú)法復(fù)制自身，只能在存在輔助病毒（如腺病毒或單純皰疹病毒）的情況下進(jìn)行復(fù)制殖演。一種常用的制造方法是將經(jīng)過(guò)改造的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系轉(zhuǎn)染三個(gè)質(zhì)粒：第一個(gè)質(zhì)粒包含所需治療基因氧秘，該基因被克隆在兩個(gè)病毒反向末端重復(fù)序列之間（這些序列有助于將基因包裝到病毒外殼中）；第二個(gè)質(zhì)粒編碼AAV的外殼和復(fù)制相關(guān)基因趴久；第三個(gè)質(zhì)粒編碼腺病毒所需的輔助功能基因丸相。大約經(jīng)過(guò)48-72小時(shí)，細(xì)胞被破裂彼棍，然后從細(xì)胞裂解物中純化出重組病毒顆粒灭忠。

從人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中已分離出許多種AAV血清型。這些血清型在對(duì)各種目標(biāo)組織的靶向性上有所不同座硕，包括肝臟弛作、骨骼肌、心肌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞华匾，包括光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞映琳。 Within the host cell, the genome of the recombinant virion persists predominantly in an episomal form, as concatemers of vector DNA. 載體DNA與宿主細(xì)胞基因組的整合可以發(fā)生，通常發(fā)生在活躍轉(zhuǎn)錄基因和雙鏈斷裂的部位蜘拉。

過(guò)去十年的一個(gè)研究重點(diǎn)是確定哪些血清型在各種目標(biāo)組織中達(dá)到最佳效果萨西。另一個(gè)重點(diǎn)是改進(jìn)制造工藝，以達(dá)到更高的產(chǎn)量和更好的純度旭旭。這一領(lǐng)域的進(jìn)展使許多最近的臨床研究得以進(jìn)行谎脯。對(duì)于需要高劑量載體的大規(guī)模試驗(yàn)，還需要進(jìn)一步的改進(jìn)持寄。

用于體內(nèi)基因遞送的其他載體

其他幾個(gè)病毒載體已被用于體內(nèi)基因遞送的臨床試驗(yàn)（見(jiàn)全球基因治療臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)）源梭。在血友病A的試驗(yàn)中，使用編碼因子VIII的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被證明是安全的稍味，但沒(méi)有達(dá)到治療水平的持續(xù)表達(dá)咸产。目前正在進(jìn)行臨床研究，利用慢病毒載體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行基因傳遞治療帕金森病仲闽。但迄今為止脑溢，大多數(shù)臨床應(yīng)用慢病毒載體的情況是在體外將基因傳遞給造血干細(xì)胞。最初的腺病毒載體引起了激烈的免疫反應(yīng)，其中一項(xiàng)試驗(yàn)治療鳥(niǎo)氨酰轉(zhuǎn)移酶缺陷癥導(dǎo)致了患者的死亡屑彻。在囊性纖維化患者中验庙，將腺病毒載體引入呼吸道是安全的，但沒(méi)有顯示出療效社牲。一項(xiàng)治療血友病A的試驗(yàn)中使用的fully deleted腺病毒載體導(dǎo)致了血小板減少和轉(zhuǎn)氨酶升高粪薛，因此該研究被中止了。然而搏恤，隨著對(duì)fully deleted腺病毒載體工程和純化技術(shù)的不斷改進(jìn)违寿，已經(jīng)在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中取得了有希望的結(jié)果，這表明這些載體仍有可能在治療遺傳疾病方面發(fā)揮作用熟空。

對(duì)于AAV的臨床應(yīng)用而言藤巢，存在一些具體的組織特異性挑戰(zhàn)。例如息罗，免疫反應(yīng)對(duì)于體內(nèi)基因遞送提出了重要挑戰(zhàn)掂咒，而不同組織的免疫反應(yīng)程度各異。此外迈喉，目標(biāo)組織在其他方面也存在差異绍刮，比如在免疫損傷下的再生能力以及最適合的基因遞送方式。因此挨摸，雖然AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)面臨一些普遍的挑戰(zhàn)（見(jiàn)框3）孩革，即使是針對(duì)同一組織，也必須考慮特定疾病的特殊情況得运。本綜述主要關(guān)注于特定組織的治療性轉(zhuǎn)基因輸送方面的進(jìn)展和挑戰(zhàn)膝蜈，包括視網(wǎng)膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）澈圈、肝臟和骨骼肌。這些組織被認(rèn)為是離臨床應(yīng)用最近的目標(biāo)帆啃，但同時(shí)也在積極研究其他目標(biāo)組織瞬女，如肺部、心臟和關(guān)節(jié)努潘。最后對(duì)迄今為止所取得的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)诽偷、尚存的挑戰(zhàn)以及未來(lái)應(yīng)用的前景進(jìn)行了分析。

BOX 3 基因治療的目標(biāo)與挑戰(zhàn)

除了某些例外情況（例如疯坤，利用鋅指核酸酶進(jìn)行基因組編輯）报慕，基因治療遺傳疾病的兩個(gè)目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的長(zhǎng)期表達(dá)，并使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物達(dá)到治療所需的高水平压怠。非整合型載體的體內(nèi)基因遞送通過(guò)將載體引入長(zhǎng)壽命的postmitotic目標(biāo)組織眠冈，如骨骼肌、心肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或肝臟組織蜗顽，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期表達(dá)布卡。即使提供的DNA沒(méi)有整合到宿主細(xì)胞的基因組中，只要載體DNA能夠穩(wěn)定保持雇盖，就可以實(shí)現(xiàn)持久表達(dá)忿等。Episomal maintenance is the mechanism，如AAV和依賴輔助的腺病毒等載體能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)期表達(dá)崔挖。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于大大降低了與載體整合相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)贸街。缺點(diǎn)是大多數(shù)感興趣的目標(biāo)細(xì)胞無(wú)法被移除、在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行處理并返回給患者狸相。因此薛匪，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)必須在體內(nèi)進(jìn)行，并且必須直接應(yīng)對(duì)人體的免疫反應(yīng)卷哩。

基因轉(zhuǎn)移策略可以分為三個(gè)關(guān)鍵要素：載體或基因遞送工具蛋辈、轉(zhuǎn)基因和目標(biāo)組織。由于人體免疫反應(yīng)是體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的主要障礙将谊，并且人體免疫反應(yīng)在不同組織中具有特異性冷溶，因此針對(duì)每個(gè)目標(biāo)組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移都存在一系列獨(dú)特的挑戰(zhàn)并不令人意外。因此尊浓，對(duì)于一個(gè)目標(biāo)組織實(shí)現(xiàn)基因遞送的解決方案可能不容易適用于其他組織逞频。此外，通過(guò)不同的給藥途徑將載體傳遞到相同組織可能會(huì)面臨不同的障礙栋齿。例如苗胀，直接肌肉注射進(jìn)行基因傳遞似乎不會(huì)受到循環(huán)中的載體抗體的影響，但通過(guò)血液傳遞到肌肉的載體必須克服中和抗體的影響瓦堵。最后基协，根據(jù)目標(biāo)組織的不同，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物或載體的免疫反應(yīng)可能占主導(dǎo)地位菇用，這凸顯出在臨床環(huán)境中實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果必須解決的另一個(gè)問(wèn)題澜驮。

視網(wǎng)膜基因遞送

在臨床基因轉(zhuǎn)移中使用AAV載體取得的最成功的例子是治療視網(wǎng)膜退行性疾病Leber氏先天性黑蒙癥（LCA）。這種臨床表型具有早發(fā)性失明和常染色體隱性遺傳特點(diǎn)惋鸥，可以由14種不同基因的突變引起杂穷。其中對(duì)于RPE65（編碼視網(wǎng)膜色素上皮特異性65 kDa蛋白的基因），通過(guò)在視網(wǎng)膜下注射表達(dá)RPE65的AAV載體卦绣，已經(jīng)在基因工程敲除小鼠和自然發(fā)生的狗疾病模型中實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期治愈耐量。

在模型生物中取得成功后，2007年滤港，英國(guó)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)和美國(guó)的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了針對(duì)由RPE65缺陷引起的LCA基因治療試驗(yàn)（圖1）廊蜒。對(duì)于載體和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)很小，這是一個(gè)預(yù)料之中的結(jié)果，因?yàn)樵囼?yàn)涉及向一個(gè)免疫豁免區(qū)輸送低劑量的載體劲藐，迄今為止注射的25多名受試者中沒(méi)有發(fā)生嚴(yán)重不良事件八堡。隨后的一年，這三個(gè)團(tuán)隊(duì)報(bào)告了通過(guò)視覺(jué)功能的視覺(jué)功能（視力和視野）聘芜、客觀指標(biāo)（如瞳孔光反應(yīng)或全視場(chǎng)光敏度）和功能測(cè)量（如在昏暗光下穿越障礙物的能力）來(lái)確定成功兄渺，并且?guī)缀跛惺茉囌叩哪承﹨?shù)都有所改善汰现。這些改善已經(jīng)持續(xù)了3年以上的時(shí)間妄田。

在視網(wǎng)膜退行性疾病中启具，RPE65缺陷的一個(gè)不尋常特征是盡管沒(méi)有視覺(jué)薯演，光感受器細(xì)胞相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間保持完整愉镰。因此隘竭，在補(bǔ)充缺失的酶后须误，可以恢復(fù)視覺(jué)，因?yàn)楣飧惺芷骷?xì)胞仍然存在鸭轮。動(dòng)物模型的臨床前研究明確表明医吊，視覺(jué)的恢復(fù)在較年輕的動(dòng)物中最為成功策严，并且臨床試驗(yàn)的結(jié)果在人類中證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。長(zhǎng)期失明的受試者恢復(fù)視力為研究人員提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)硕蛹，可以評(píng)估長(zhǎng)期感官剝奪后視網(wǎng)膜功能恢復(fù)對(duì)視覺(jué)皮層的影響。這些受試者的功能性磁共振成像研究將幫助研究人員了解在長(zhǎng)期嚴(yán)重視力障礙后硕并，視覺(jué)皮層神經(jīng)元對(duì)視網(wǎng)膜功能恢復(fù)的響應(yīng)妓美。這些研究揭示了基因治療在增進(jìn)對(duì)疾病病理生理的理解以及確定疾病可逆性邊界方面的潛力（determine the boundaries of disease reversibility）。

持續(xù)進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)和計(jì)劃中的試驗(yàn)可能會(huì)改變眼科實(shí)踐的某些方面鲤孵。以往由于缺乏治療手段壶栋，對(duì)具有遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病的個(gè)體進(jìn)行基因型分型并不那么重要，但隨著進(jìn)展的持續(xù)普监，這將變得重要起來(lái)贵试。此外，對(duì)于玻璃體視網(wǎng)膜外注射技術(shù)的需求將增加凯正，需要具備這方面專長(zhǎng)的玻璃體視網(wǎng)膜外科醫(yī)生毙玻。DNA診斷技術(shù)的快速發(fā)展也正在擴(kuò)大新生兒篩查的范圍，將來(lái)可能在出生時(shí)就能識(shí)別受影響的個(gè)體廊散。

基因治療視網(wǎng)膜退行性疾病的長(zhǎng)期目標(biāo)是在最有可能產(chǎn)生最佳結(jié)果的疾病階段進(jìn)行雙側(cè)治療桑滩，這通常是在診斷后盡可能早的階段。因此允睹，該領(lǐng)域?qū)⑿枰谏缙诖_定雙側(cè)給藥的安全性运准。如果能在3歲的兒童中安全地進(jìn)行給藥，這將為其他視網(wǎng)膜退行性疾病提供重要的支持?jǐn)?shù)據(jù)缭受，特別是對(duì)于這些疾病中光感受器存活時(shí)間不長(zhǎng)且早期治療對(duì)于視力恢復(fù)至關(guān)重要的情況胁澳。

這些有希望的針對(duì)RPE65缺陷引起的LCA的基因治療研究為基因治療提供了更為普遍的啟示。首先米者，它們強(qiáng)調(diào)了對(duì)許多遺傳疾病至關(guān)重要的一個(gè)問(wèn)題：基因治療在疾病發(fā)展階段對(duì)臨床結(jié)果的影響韭畸。雖然這一點(diǎn)在致命的退行性疾病（如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥或巴頓氏猜恪）中最容易理解胰丁，但在視網(wǎng)膜退行性疾病等疾病中也同樣適用。甚至對(duì)于血友病而言喂分，超過(guò)一定階段后锦庸，由于反復(fù)關(guān)節(jié)出血引起的漸進(jìn)性損傷將不再可逆，即使恢復(fù)正常凝血因子水平也無(wú)法逆轉(zhuǎn)妻顶。另一個(gè)值得強(qiáng)調(diào)的觀點(diǎn)是酸员，新型治療方法（如基因轉(zhuǎn)移）的早期發(fā)展在很大程度上取決于臨床研究中最初選擇的疾病模型。盡管RPE65缺陷由于疾病人口規(guī)模較小一直無(wú)法吸引商業(yè)支持進(jìn)行臨床試驗(yàn)讳嘱，然而，這種疾病的概念驗(yàn)證為許多更常見(jiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病（如Leber遺傳性視神經(jīng)病變身隐，choroideraemia and X?linked retinoschisis）以及與年齡有關(guān)的疾病其徙，如老年性黃斑變性的試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

肝臟基因遞送

肝臟作為主要的合成器官之一钝鸽，仍然是基因轉(zhuǎn)移研究中非常理想的靶點(diǎn)汇恤。成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟的長(zhǎng)期基因轉(zhuǎn)移不僅有潛力治療各種血漿蛋白缺乏癥，還可以治療代謝性疾病拔恰，如鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶缺乏癥（OTC缺陷）因谎、甲基丙二酸血癥、家族性高膽固醇血癥綜合征颜懊，以及一些溶酶體貯積病的生化（但不一定是中樞神經(jīng)系統(tǒng)）效應(yīng)财岔。事實(shí)上，在小型和大型動(dòng)物模型中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了許多此類疾病的長(zhǎng)期治愈（表2）河爹。在臨床領(lǐng)域的成功一直比較緩慢匠璧，但最近的研究表明，目前正在朝著長(zhǎng)期表達(dá)的目標(biāo)進(jìn)展咸这。

肝臟給藥治療血友病B

到目前為止夷恍，唯一對(duì)肝臟進(jìn)行AAV（腺相關(guān)病毒）治療的試驗(yàn)是針對(duì)嚴(yán)重血友病B的試驗(yàn)，這是由于血液凝血因子IX基因突變引起的出血性疾病媳维。目前該疾病通常通過(guò)靜脈輸注凝血因子濃縮物進(jìn)行治療酿雪，但這些治療方法相當(dāng)昂貴（對(duì)于嚴(yán)重疾病的成年人進(jìn)行預(yù)防性治療，每年費(fèi)用超過(guò)20萬(wàn)美元）侄刽，而且估計(jì)全球只有約20%的血友病患者能夠承擔(dān)這些治療方案执虹。對(duì)于最貧困的人群來(lái)說(shuō)，這種疾病在兒童或青少年時(shí)期仍然是致命的唠梨。除了這種未滿足的需求袋励，還有一些其他因素使血友病成為肝臟基因轉(zhuǎn)移的理想目標(biāo)：治療窗口寬廣（將因子IX水平提高到正常水平的>2%將改善表型，而水平高達(dá)150%仍然在正常范圍內(nèi)）当叭；終點(diǎn)易于測(cè)量茬故；并且已有小型和大型動(dòng)物模型可用于該疾病的研究。

AAV-因子IX肝臟試驗(yàn)最初是基于在兩個(gè)血友病B犬模型中進(jìn)行的臨床前研究中得到了強(qiáng)有力結(jié)果蚁鳖，并結(jié)合了在八名患有嚴(yán)重血友病B的患者中進(jìn)行的類似臨床試驗(yàn)的AAV載體編碼因子IX的安全性結(jié)果磺芭。犬模型的研究顯示，不論是通過(guò)肝動(dòng)脈還是門(mén)靜脈給予載體醉箕，都可以長(zhǎng)期表達(dá)犬因子IX钾腺，并且在向肝臟注射載體后未觀察到抑制性抗體的產(chǎn)生徙垫。隨后的研究進(jìn)一步證實(shí)，從AAV載體在肝臟中轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物有助于促進(jìn)對(duì)其的耐受性放棒。這一結(jié)果也在使用其他載體姻报，如慢病毒載體和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行的研究中得到了驗(yàn)證。

第一次AAV-因子IX試驗(yàn)使用了帶有肝特異性啟動(dòng)子的AAV2載體（圖2a）间螟，并通過(guò)肝動(dòng)脈給予載體吴旋。AAV-因子IX肝臟試驗(yàn)的啟動(dòng)面臨了幾個(gè)障礙。首先厢破，此前從未在人體肝臟中使用AAV載體進(jìn)行過(guò)治療荣瑟，而且在那時(shí)，基因治療試驗(yàn)中唯一的死亡事件發(fā)生在一項(xiàng)使用腺病毒載體在OTC缺陷患者肝臟中進(jìn)行的試驗(yàn)中摩泪。因此笆焰，監(jiān)管機(jī)構(gòu)合理地要求AAV試驗(yàn)從低劑量開(kāi)始進(jìn)行。盡管有這些限制见坑，但在一個(gè)受試者中明確展示了療效仙辟，最高劑量測(cè)試時(shí)循環(huán)因子IX水平達(dá)到正常水平的10-12%。然而鳄梅，增高的因子IX水平僅持續(xù)約10周（圖2b）叠国，因此未能實(shí)現(xiàn)另一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)，即長(zhǎng)期表達(dá)戴尸，并且有懷疑認(rèn)為轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞被有選擇性地丟失或破壞了粟焊。第二個(gè)受試者在治療前未顯示出因子IX表達(dá)或轉(zhuǎn)氨酶升高的跡象，但在治療前已檢測(cè)到對(duì)AAV的中和抗體孙蒙，據(jù)推測(cè)這些抗體阻止了肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖2c）项棠。之后試驗(yàn)進(jìn)行了修改，以便收集外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）挎峦，結(jié)果顯示CD8+ T細(xì)胞對(duì)AAV外殼蛋白產(chǎn)生了免疫反應(yīng)（圖2d）香追，并暗示AAV-因子IX轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞在細(xì)胞表面呈現(xiàn)了外殼蛋白來(lái)源的肽段，從而使得肝細(xì)胞成為活化的T細(xì)胞破壞的目標(biāo)坦胶。有理論認(rèn)為透典，這種反應(yīng)在人類而非其他物種中出現(xiàn)，是因?yàn)榇嬖谝恍〔糠钟洃汣D8+ T細(xì)胞顿苇，這些細(xì)胞在向受試者輸注載體后進(jìn)行增殖峭咒，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞被破壞（圖3）。

這項(xiàng)研究闡述了在向循環(huán)系統(tǒng)中輸注載體時(shí)可能出現(xiàn)的免疫反應(yīng)相關(guān)問(wèn)題纪岁。首先凑队，它確認(rèn)了中和抗體會(huì)阻止通過(guò)血液傳遞的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，即使在靠近目標(biāo)細(xì)胞（例如肝細(xì)胞的肝動(dòng)脈）的位置輸注也是如此幔翰。這在動(dòng)物模型中已經(jīng)得到了有力的證實(shí)漩氨，并且正在進(jìn)行的人體試驗(yàn)結(jié)果似乎也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)西壮。其次，這些發(fā)現(xiàn)至少與一個(gè)假設(shè)一致叫惊，即在肝臟中從AAV載體表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可能促進(jìn)對(duì)該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的耐受性款青。第三，該研究表明赋访，在向受試者輸注載體后會(huì)引發(fā)針對(duì)外殼蛋白的特異性T細(xì)胞活化。隨后的研究表明缓待，這種反應(yīng)與劑量有關(guān)蚓耽，并且至少在幾種其他AAV血清型中（包括AAV1和AAV8）也存在這種反應(yīng)（詳見(jiàn)下文）。然而旋炒，至今仍無(wú)法確定導(dǎo)致第一次肝臟試驗(yàn)中高劑量組中基因表達(dá)喪失的原因步悠。記憶T細(xì)胞假設(shè)難以被證實(shí)或否定。一些替代假設(shè)被提出瘫镇，但每個(gè)假設(shè)之間存在相互矛盾的證據(jù)鼎兽，并且沒(méi)有被證實(shí)或否定。然而铣除，數(shù)據(jù)清楚地顯示谚咬，人類與低等哺乳動(dòng)物在抗原呈遞和/或T細(xì)胞反應(yīng)性方面存在差異。這些差異可能解釋了為何一些動(dòng)物研究未能在人類中重現(xiàn)相同的發(fā)現(xiàn)尚粘。相比之下择卦，體外模型在研究AAV外殼抗原的處理和呈遞、以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞清除轉(zhuǎn)導(dǎo)的人類細(xì)胞方面更加可靠郎嫁。此外秉继，需要強(qiáng)調(diào)的是，盡管免疫介導(dǎo)的對(duì)肝臟或骨骼肌的損傷通常是可逆的（因?yàn)檫@些組織具有較強(qiáng)的再生能力）泽铛，但對(duì)心臟組織或中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的類似損傷可能不那么良性尚辑。

肝臟給藥的未來(lái)前景

目前正在研究?jī)煞N策略來(lái)避免在第一次肝臟試驗(yàn)中檢測(cè)到的免疫反應(yīng)。第一種策略是在向患者注入載體的同時(shí)盔腔，聯(lián)合短期的免疫抑制治療杠茬，試圖阻止外殼蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)的激活和增殖，直到外殼蛋白已被降解并從轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞中清除弛随。第二種策略是研究人員開(kāi)發(fā)了更高效的表達(dá)載體澈蝙，以在劑量較低的情況下實(shí)現(xiàn)治療水平的因子IX表達(dá)，從而避免引發(fā)免疫反應(yīng)撵幽。這種載體更高效的特點(diǎn)包括：使用對(duì)肝臟具有強(qiáng)烈趨向性且可經(jīng)靜脈注入的AAV8亞型灯荧；使用自補(bǔ)充載體設(shè)計(jì)，克服對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)制合成所需第二鏈的依賴盐杂；以及優(yōu)化密碼子逗载，提高轉(zhuǎn)錄效率哆窿。在早期的肝臟試驗(yàn)中，以2 × 10^12病毒基因組（vg）/kg的載體劑量厉斟，達(dá)到了10-12%的循環(huán)因子IX水平挚躯。在使用AAV8的試驗(yàn)中，一個(gè)受試者在2 × 10^10 vg/kg的劑量下達(dá)到了2%的水平擦秽。劑量逐步增加到6 × 10^10 vg/kg后码荔，兩名接受輸注的受試者中有一名達(dá)到了4%的循環(huán)水平。另一名受試者沒(méi)有表達(dá)感挥，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)其在治療前存在低滴度的針對(duì)AAV的中和抗體缩搅，這在初始篩查中未被檢測(cè)出來(lái)。在這個(gè)第二個(gè)試驗(yàn)的前兩個(gè)劑量組中触幼，沒(méi)有任何受試者的血清轉(zhuǎn)氨酶發(fā)生任何變化硼瓣。

由于使用基于PCR的方法來(lái)確定雙鏈載體的滴度的復(fù)雜性，使得兩個(gè)試驗(yàn)中劑量的比較變得困難置谦。然而堂鲤，第二個(gè)試驗(yàn)表明，可以穩(wěn)定維持治療水平的因子IX表達(dá)媒峡。仍有一些問(wèn)題需要解決瘟栖，其中首要問(wèn)題是，在不出現(xiàn)毒性之前谅阿，劑量可以增加到多高慢宗？盡管已經(jīng)測(cè)試過(guò)的劑量在血友病B治療中已經(jīng)達(dá)到了治療水平的因子IX表達(dá)，但對(duì)于將來(lái)在肝臟中進(jìn)行其他潛在應(yīng)用的情況奔穿，這個(gè)問(wèn)題可能是一個(gè)關(guān)注點(diǎn)镜沽。其次，對(duì)于具有針對(duì)AAV8的中和抗體的個(gè)體（約占總?cè)丝诘?0%）贱田，有哪些治療選擇缅茉？第三，目前在肝臟中研究的劑量下男摧，這種以非整合性載體為主的載體整合以及由此產(chǎn)生的插入性誘變的風(fēng)險(xiǎn)是什么蔬墩？

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因傳遞

已經(jīng)進(jìn)行了一些早期階段的臨床研究，嘗試通過(guò)基因遞送來(lái)治療遺傳性退行性疾病耗拓，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中拇颅。然而，這些研究在治療視網(wǎng)膜退行性疾病方面并未取得明顯的成功乔询。

當(dāng)前在基因遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面樟插，存在兩個(gè)核心挑戰(zhàn)限制著治療的范圍。首先是局部遞送與全面遞送的問(wèn)題。雖然在某些疾不拼浮（如帕金森蔡掠А）中局部遞送已被證明具有治療效果，但對(duì)于大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病鸵熟，需要對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行全面遞送副编。第二個(gè)問(wèn)題是血腦屏障（BBB），它是向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞所有治療藥物的障礙流强。由于大腦是高度血管化的器官痹届，靜脈內(nèi)途徑的遞送方式具有吸引力，但克服血腦屏障在這方面是一個(gè)挑戰(zhàn)打月。該領(lǐng)域通過(guò)利用或改變病毒載體的特性以及探索一系列遞送技術(shù)來(lái)應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題队腐。

載體：靶向性和改造

尋找適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因遞送的最佳AAV載體血清型是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。通過(guò)AAV1介導(dǎo)的CLN2基因遞送（該基因編碼三肽基肽酶1（TPP1））僵控，在晚期嬰兒型神經(jīng)細(xì)胞棕垢脂質(zhì)沉積癥（LINCL）的小鼠模型中已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果香到。近期研究發(fā)現(xiàn)鱼冀，AAV9是一種新發(fā)現(xiàn)的血清型报破，它能夠通過(guò)軸突傳輸將病毒顆粒運(yùn)送到離注射部位較遠(yuǎn)的位置，顯示出了高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力千绪。目前的工作還致力于確定AAV載體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同細(xì)胞類型（例如神經(jīng)元充易、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）的靶向能力。

對(duì)于基因傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究來(lái)說(shuō)荸型，通過(guò)改變AAV載體的外殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行工程修飾盹靴，以改變其自然特性，是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域瑞妇。陳等人利用溶酶體貯積病患者腦內(nèi)血管內(nèi)皮的疾病特異性變化稿静，成功地將AAV載體的靶向性重定向到小鼠體內(nèi)。他們發(fā)現(xiàn)了一些在疾病動(dòng)物腦內(nèi)血管內(nèi)皮中唯一結(jié)合的多肽序列辕狰，并將其插入到載體的外殼蛋白中改备，從而實(shí)現(xiàn)了治療性基因產(chǎn)物通過(guò)血管內(nèi)皮傳遞到整個(gè)大腦的目標(biāo)。這些基因產(chǎn)物穿過(guò)血腦屏障后蔓倍，能夠在患者的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)相互糾正悬钳，并改善兩種溶酶體貯積病模型（如LINCL和粘多糖貯積病VII型）小鼠的表型。類似的策略也被用于在藥物誘導(dǎo)的癲癇大鼠中設(shè)計(jì)AAV載體偶翅，使其能夠穿越血腦屏障默勾。然而，需要進(jìn)一步研究來(lái)確定人類腦內(nèi)血管內(nèi)皮的疾病的特異性分子特征聚谁，這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有所不同母剥。

未經(jīng)改良的AAV9載體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因遞送中具有潛在的用途，因?yàn)樗@示出穿越血腦屏障的能力媳搪，這一結(jié)果在小型和大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中已得到證實(shí)铭段。然而，針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的系統(tǒng)性AAV9基因遞送仍存在一些潛在的障礙秦爆。首先序愚，體液免疫會(huì)阻礙轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，使得達(dá)到治療水平的基因表達(dá)變得困難等限。其次爸吮，為了在大腦中實(shí)現(xiàn)治療水平的基因表達(dá)，需要使用更高劑量的載體望门。此外形娇，還存在非特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致對(duì)心肌細(xì)胞等非目標(biāo)組織的影響筹误。對(duì)于這些障礙桐早，需要進(jìn)一步研究和改進(jìn)，以提高AAV9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因傳遞中的應(yīng)用效果厨剪，并確保其安全性哄酝。

遞送技術(shù)

對(duì)于大多數(shù)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病而言，全面遞送至大腦是非常重要的祷膳。除了進(jìn)行AAV血清型分析之外陶衅，還有其他一些遞送技術(shù)已成功應(yīng)用于非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的AAV載體遞送。其中包括利用靜水壓通過(guò)血管周圍間隙進(jìn)行對(duì)流增強(qiáng)遞送直晨，使治療物質(zhì)擴(kuò)散到大腦的遠(yuǎn)離部位搀军。通過(guò)將載體注入腦室中，也已在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的更廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)勇皇，這使得載體能夠通過(guò)腦脊液（CSF）循環(huán)罩句。目前還不清楚是否可以成功將這種或類似的經(jīng)CSF途徑（鞘內(nèi)給藥和延髓池給藥）應(yīng)用于人體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全面遞送敛摘∶爬茫總的來(lái)說(shuō)，所有針對(duì)大腦的新技術(shù)在嚙齒動(dòng)物中的概念驗(yàn)證還需在大型動(dòng)物模型中進(jìn)行確認(rèn)着撩，以更接近人腦的結(jié)構(gòu)和體積分布诅福。

盡管全面?zhèn)鬟f仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，但使用當(dāng)前的立體定位注射技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部傳遞拖叙。因此氓润，一些最初的臨床工作已經(jīng)著眼于帕金森病或阿爾茨海默病等疾病，因?yàn)榫植總鬟f可能會(huì)產(chǎn)生治療效果薯鳍。例如咖气，通過(guò)立體定位注射將慢病毒載體攜帶的基因遞送到受帕金森病影響的人類大腦中挨措，雖然在大多數(shù)情況下帕金森病不是一種遺傳疾病，但這是迄今為止神經(jīng)退行性疾病取得最明顯成功的案例崩溪。這種成功可能是因?yàn)榱Ⅲw定位注射的局部傳遞可以針對(duì)疾病的主要病理特點(diǎn)浅役，即黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元的退行性變化和對(duì)紋狀體多巴胺輸入的喪失。局部傳遞攜帶編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶的AAV載體也已經(jīng)被證明在約5 × 10^11 vg的載體劑量下是安全的伶唯；大多數(shù)不良事件與載體的管理過(guò)程本身有關(guān)觉既，這與用于顱內(nèi)注射的外科手術(shù)程序相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)是一致的。

研究人員還嘗試使用向多個(gè)部位進(jìn)行腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射的方式來(lái)處理需要在更大范圍（即全面?zhèn)鬟f）進(jìn)行基因遞送的神經(jīng)退行性疾病乳幸，尤其是對(duì)于Canavan病和Batten病這兩種嚴(yán)重且致命的兒童神經(jīng)退行性疾病瞪讼。Canavan病是一種缺乏天冬酰胺酰化酶（ASPA）酶的疾病粹断，對(duì)于這種疾病的AAV試驗(yàn)是最早將載體引入大腦的臨床研究之一符欠。將編碼ASPA cDNA的AAV2載體以劑量高達(dá)1 × 10^12 vg的方式注入十名患有該病的兒童患者中。通過(guò)六個(gè)顱骨孔進(jìn)行向腦部注射（每個(gè)孔一個(gè)注射點(diǎn)）瓶埋，并未出現(xiàn)意外的不良事件希柿。該研究旨在評(píng)估安全性，尚未公布任何療效數(shù)據(jù)养筒。

在類似的方法下曾撤，Worgall和他的同事進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于Batten病的基因遞送的臨床研究，這是一種主要影響大腦的常染色體隱性溶酶體貯積病闽颇。Batten病的一個(gè)亞型LINCL是由CLN2基因突變引起的盾戴，該基因編碼TPP1酶寄锐。在患有該疾病的十名兒童中兵多，載體直接注入大腦實(shí)質(zhì)，劑量為1.8-3.2 × 10^12顆粒單位橄仆，同樣通過(guò)六個(gè)顱骨孔剩膘，但每個(gè)孔進(jìn)行兩次注射，共計(jì)12個(gè)注射點(diǎn)盆顾，全部位于大腦皮層怠褐。在這項(xiàng)研究中，其中一名患者在接受載體注射后的14天出現(xiàn)難治性癲癇您宪，導(dǎo)致患者在載體注射后的49天死亡奈懒。腦成像和腦脊液分析未檢測(cè)到腦炎，但未獲得進(jìn)行尸檢的許可宪巨，因此無(wú)法確定這一不良事件是否與潛在疾病的進(jìn)展磷杏、手術(shù)過(guò)程或研究中測(cè)試的藥物有關(guān)。在其他患者中捏卓，一些改善被觀察到极祸，為同一研究團(tuán)隊(duì)最近啟動(dòng)的I/II期研究奠定了基礎(chǔ)（ClinicalTrials.gov識(shí)別號(hào)：NCT01161576）。這項(xiàng)新研究使用相同的遞送技術(shù)和表達(dá)載體，但將其打包到AAVrh10血清型中遥金，而不是前期試驗(yàn)中使用的AAV2外殼浴捆。轉(zhuǎn)換到這種血清型的決策基于小鼠模型的臨床前研究，顯示AAVrh10血清型在大腦中的分布范圍更廣稿械，TPP1的表達(dá)水平更高选泻，并與AAV2、AAV5和AAV8向量相比美莫，疾病矯正效果更好滔金。這些努力具有重要意義，但顯然對(duì)于大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病茂嗓，可能需要全面的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移才能實(shí)現(xiàn)治療效果餐茵。

遞送至CNS的其他考慮因素

還有兩個(gè)問(wèn)題需要特別強(qiáng)調(diào)，這些問(wèn)題涉及基因遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)述吸。首先忿族，對(duì)于這些疾病來(lái)說(shuō)，可能需要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆變化之前進(jìn)行早期治療干預(yù)蝌矛，這一點(diǎn)與視網(wǎng)膜退行性疾病的情況相似道批。盡管有一些研究表明我們尚未完全了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，但根據(jù)酶替代療法的數(shù)據(jù)入撒，某些疾病進(jìn)展可能是不可逆轉(zhuǎn)的隆豹。其次，在開(kāi)發(fā)這些以前無(wú)法治療的疾病的臨床研究中茅逮，面臨著一個(gè)挑戰(zhàn)璃赡，即缺乏明確定義的臨床研究終點(diǎn)。這一挑戰(zhàn)可能更加突出在患者人數(shù)較少献雅、疾病進(jìn)展的自然歷史不明確以及尚未驗(yàn)證用于監(jiān)測(cè)治療效果的生物標(biāo)志物的情況下碉考。

骨骼肌基因遞送

肌肉是基因遞送策略中的一個(gè)理想靶組織，用于矯正神經(jīng)肌肉疾病挺身、代謝性疾病和遺傳性蛋白缺乏癥侯谁，如血友病B、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和脂蛋白脂酶（LPL）缺乏癥章钾。通過(guò)肌肉的肌內(nèi)注射是迄今為止最常用的向肌肉傳遞載體的途徑墙贱，具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：傳遞過(guò)程簡(jiǎn)單易行并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用；向目標(biāo)組織外傳播的程度相對(duì)較屑惨撇；預(yù)先存在的抗-AAV抗體不會(huì)阻礙轉(zhuǎn)導(dǎo)。

相反窍箍，相較于其他靶器官（如肝臟）串纺，將AAV載體注射到骨骼肌通常更容易引發(fā)抗轉(zhuǎn)基因免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加丽旅。此外，肌纖維向循環(huán)系統(tǒng)的分泌效率相對(duì)較低纺棺，這對(duì)于血漿蛋白缺乏等疾病而言是一個(gè)問(wèn)題榄笙，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)物的有效分泌至循環(huán)系統(tǒng)對(duì)于治療的成功至關(guān)重要。此外祷蝌，目前尚無(wú)能夠在臨床上實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)肌肉組織（包括膈济┳病）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，而這對(duì)于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病的治療效果來(lái)說(shuō)是必需的巨朦。

肌肉注射給藥

第一項(xiàng)關(guān)于AAV載體肌肉注射的臨床研究始于1999年米丘，用于治療血友病B『龋基于對(duì)血友病犬的研究拄查，很明顯使用這種途徑進(jìn)行治療會(huì)導(dǎo)致抗轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物因子IX的抗體形成的風(fēng)險(xiǎn)。因此棚蓄，該試驗(yàn)限制在攜帶有錯(cuò)義突變引起的血友病B的個(gè)體中（這些個(gè)體對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表現(xiàn)出某種程度的耐受性）堕扶，并排除了任何先前有蛋白質(zhì)輸注治療導(dǎo)致抗體形成的歷史的個(gè)體。在所有八名受試者中梭依，基因轉(zhuǎn)移都成功進(jìn)行了稍算；通過(guò)肌肉活檢證實(shí)了基因的表達(dá)，并且該程序安全且耐受性良好役拴。然而糊探，循環(huán)中因子IX的水平較低，可能是由于所使用的劑量較低河闰，低于根據(jù)血友病B犬研究預(yù)測(cè)的治療劑量科平。盡管使用其他AAV血清型在小鼠中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但在血友病犬中的研究表明淤击，在雜交匠抗、免疫能力正常的大型動(dòng)物中故源，該方法會(huì)導(dǎo)致抗體的發(fā)生：這對(duì)于血友病而言是無(wú)法接受的結(jié)果污抬。

這一血友病B的初步經(jīng)驗(yàn)為其他遺傳性疾病的肌肉內(nèi)基因遞送類似設(shè)計(jì)的臨床研究鋪平了道路。這些研究表明绳军，根據(jù)所需的表達(dá)水平和遞送基因產(chǎn)物的分泌需求印机，肌肉內(nèi)注射可能對(duì)某些應(yīng)用是足夠的。例如门驾，阿姆斯特丹分子治療公司的研究人員使用肌肉內(nèi)注射AAV1載體表達(dá)LPL的天然變異體射赛，探索了一種治療LPL缺乏癥的新方法。盡管三酸甘油酯水平的降低似乎只是暫時(shí)的奶是，該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)初步報(bào)告了超過(guò)25名受影響患者中胰腺炎發(fā)作次數(shù)減少的結(jié)果楣责。這些研究還值得注意的是在向受試者進(jìn)行短期免疫抑制治療（見(jiàn)下文）竣灌；這種方法在未來(lái)可能會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。另一組正在評(píng)估肌肉內(nèi)注射AAV1載體作為α1抗胰蛋白酶缺乏癥的新治療方法秆麸，他們報(bào)告稱初嘹，盡管小鼠中相似劑量的治療效果顯著，但劑量高達(dá)約1 × 10^12 vg/kg仍然只能達(dá)到所需治療效果的1/200沮趣。這些結(jié)果表明屯烦，對(duì)于某些疾病應(yīng)用，可能需要更高效的傳遞途徑或更高效的表達(dá)載體房铭。

遞送到更大的肌肉區(qū)域

肌肉相關(guān)基因遞送正在開(kāi)發(fā)中的另一主要疾病群體是肌營(yíng)養(yǎng)不良癥驻龟。針對(duì)這些疾病的研究已經(jīng)開(kāi)創(chuàng)了新的遞送方法，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的廣泛的肌肉組織缸匪，從而實(shí)現(xiàn)治療的成功翁狐。

Su等人的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用靜水壓凌蔬，可以改變毛細(xì)血管后小靜脈相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間的接觸強(qiáng)度谴蔑，從而使基因載體從循環(huán)系統(tǒng)滲透至肌肉組織，并實(shí)現(xiàn)安全有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)龟梦。這種方法已在血友病B犬中實(shí)現(xiàn)了治療水平的因子IX表達(dá)隐锭，而且在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中也得到了類似的結(jié)果，包括攜帶微型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因的基因載體计贰。目前钦睡，該方法正在對(duì)Becker型肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥患者進(jìn)行初步測(cè)試，盡管目前使用的是鹽水而不是真正的基因載體躁倒。

盡管有證據(jù)表明與肌肉內(nèi)注射相比荞怒，靜脈內(nèi)給予AAV載體的方法不太容易引發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，但全身給藥使得載體更容易被預(yù)先存在的抗體中和秧秉，并且在體內(nèi)更廣泛地分布褐桌。

解決衣殼和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)

在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到肌肉中的過(guò)程中，避免引發(fā)免疫反應(yīng)對(duì)療效產(chǎn)生負(fù)面影響是一個(gè)重要挑戰(zhàn)象迎。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明荧嵌，針對(duì)AAV包膜的T細(xì)胞反應(yīng)與劑量有關(guān)，較高的載體劑量導(dǎo)致循環(huán)反應(yīng)性T細(xì)胞在PBMC樣本中的比例增加砾淌，以及反應(yīng)性受試者的比例增加啦撮。作者實(shí)驗(yàn)室在LPL缺乏癥的AAV1基因遞送的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行的研究表明，較高劑量的載體也可能導(dǎo)致包膜特異性T細(xì)胞更早地出現(xiàn)在外周血液中汪厨，即劑量依賴性可能表現(xiàn)為反應(yīng)速度加快而非反應(yīng)強(qiáng)度增加赃春。在AAV1-LPL載體輸送過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行免疫抑制可以阻斷3 × 10^11 vg/kg的載體劑量下的T細(xì)胞激活，然而劫乱，劑量逐步升高至1 × 10^12 vg/kg后织中，盡管進(jìn)行了免疫抑制锥涕，仍然可以檢測(cè)到外周血液中的針對(duì)包膜的T細(xì)胞。

盡管現(xiàn)在已經(jīng)明確狭吼，AAV載體在人體內(nèi)的使用會(huì)導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的激活站楚，但仍然存在一個(gè)問(wèn)題，即這些反應(yīng)是否對(duì)臨床有害或?qū)蜣D(zhuǎn)導(dǎo)的療效產(chǎn)生負(fù)面影響搏嗡。Two studies associated early detection of capsid-specific T cells with lack of evidence of target tissue transduction in some of the subjects in each series. 包膜特異性T細(xì)胞的激活結(jié)果可能受到多種因素的影響窿春，包括：轉(zhuǎn)基因本身的免疫調(diào)節(jié)特性；靶組織中MHC-I的表達(dá)水平采盒；靶組織的炎癥反應(yīng)旧乞；反應(yīng)性T細(xì)胞的凋亡；以及受試者人類白細(xì)胞抗原（HLA）等位基因的變異性磅氨。在未來(lái)進(jìn)行AAV肌肉基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的臨床研究中監(jiān)測(cè)包膜免疫反應(yīng)將對(duì)澄清這些問(wèn)題至關(guān)重要尺栖。

最近的一項(xiàng)研究突出了AAV介導(dǎo)的肌肉內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一個(gè)方面，即細(xì)胞免疫反應(yīng)也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物上烦租。通過(guò)肌肉內(nèi)注射延赌，將編碼功能性截短版本的dystrophin蛋白的AAV載體遞送給肌萎縮癥患者。 缺乏長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與檢測(cè)到的針對(duì)mini-dystrophin基因而非患者內(nèi)源性dystrophin基因的序列的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)叉橱。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了肌萎縮癥和其他疾病中的難題挫以，即宿主免疫系統(tǒng)可能阻礙轉(zhuǎn)基因的持續(xù)表達(dá)，并進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了基因遞送臨床研究中免疫監(jiān)測(cè)的重要性窃祝。

結(jié)論和未來(lái)展望

病毒載體介導(dǎo)的基因遞送可以說(shuō)是迄今為止最復(fù)雜的治療方法掐松，涉及到DNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)組成部分。盡管如此粪小，在大約20年的臨床研究后大磺，已經(jīng)取得了治療成功。這個(gè)發(fā)展時(shí)間表與單克隆抗體類似探膊，并且與骨髓移植相比也有很好的對(duì)比杠愧。正如我們所討論的，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)面臨許多組織特異性的障礙逞壁。例如流济，在實(shí)現(xiàn)全面在大腦中遞送和在全身遞送大部分骨骼肌以治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良方面，存在不同的挑戰(zhàn)和策略猾担。對(duì)于臨床試驗(yàn)而言袭灯，也存在著特定組織對(duì)風(fēng)險(xiǎn)容忍度的限制。骨骼肌和肝臟可以容忍一定程度的免疫介導(dǎo)的損傷并且仍然可以再生绑嘹，而腦和心肌的恢復(fù)能力更有限上鞠。

迄今最成功的例子是通過(guò)將基因遞送到視網(wǎng)膜下間隙治療由RPE65基因突變引起的LCA娄涩，并且這種方法對(duì)于其他遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病也具有潛力怎憋，只要治療用的cDNA足夠小以適應(yīng)AAV載體屿衅。對(duì)于由RPE65突變引起的LCA和其他疾病，該領(lǐng)域需要確定治療干預(yù)的最低擅腰、最高和最佳年齡范圍蟋恬，這可能是疾病特異性的。對(duì)于更普遍的神經(jīng)退行性疾病趁冈，有希望的結(jié)果表明歼争，能夠通過(guò)向免疫豁免組織的局部區(qū)域輸送小劑量的載體來(lái)改善疾病，帕金森病就是一個(gè)很好的例子渗勘。然而沐绒，要擴(kuò)大到其他神經(jīng)退行性疾病的應(yīng)用，就需要解決全面?zhèn)鬟f的問(wèn)題旺坠，需要探索新的遞送途徑和進(jìn)行載體工程方面的研究乔遮。

針對(duì)其他目標(biāo)組織，進(jìn)展較慢取刃，但也取得了許多有希望的進(jìn)展蹋肮。例如，在肝臟方面璧疗，對(duì)使用AAV8載體表達(dá)因子IX的試驗(yàn)的初步結(jié)果令人鼓舞坯辩，如果能夠安全地針對(duì)肝臟，這可能為擴(kuò)大應(yīng)用奠定基礎(chǔ)崩侠。此外濒翻，肌肉遞送方面的技術(shù)進(jìn)展使研究人員在某些疾病（如血友病B和肌營(yíng)養(yǎng)不良）所需的廣泛肌肉遞送方面更近了一步啦膜。針對(duì)基因遞送載體和治療性轉(zhuǎn)基因的免疫反應(yīng)仍然是未解決的問(wèn)題有送，可能存在潛在的安全問(wèn)題，需要加以解決僧家。

迄今為止雀摘，AAV的臨床基因治療研究給我們帶來(lái)了幾個(gè)重要經(jīng)驗(yàn)：疾病階段對(duì)治療結(jié)果的決定至關(guān)重要，對(duì)于一些疾病來(lái)說(shuō)八拱，早期干預(yù)至關(guān)關(guān)鍵阵赠；在預(yù)測(cè)AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中，小型和大型動(dòng)物模型對(duì)劑量和其他方面的預(yù)測(cè)非常有用肌稻；同時(shí)清蚀，為了那些尚無(wú)有效治療方法的疾病，我們需要建立嚴(yán)格的自然病史數(shù)據(jù)庫(kù)爹谭，評(píng)估臨床相關(guān)的終點(diǎn)指標(biāo)隨時(shí)間的變化枷邪。

對(duì)于大多數(shù)臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，還有一些問(wèn)題需要解決诺凡；需要建立符合當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范的大規(guī)模制造工藝东揣，以及確定載體滴度的標(biāo)準(zhǔn)化方法践惑。此外，還必須解決與AAV載體引起的低但有一定的插入性誘變風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的問(wèn)題嘶卧。對(duì)于某些組織（如呼吸道）的高效基因遞送來(lái)治療囊性纖維化和其他肺部疾捕酢（表1），仍需在人體中進(jìn)行研究芥吟。此外侦铜，還需要進(jìn)行額外的研究來(lái)確認(rèn)針對(duì)獲得性疾病（如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的基因治療的安全性和有效性钟鸵，已經(jīng)進(jìn)行了針對(duì)滑膜組織的基因遞送的人體研究（表1）钉稍。值得注意的是，基因治療的長(zhǎng)期目標(biāo)是進(jìn)一步發(fā)展超越基因替代的基因組編輯技術(shù)携添，最近使用鋅指核酸酶取得了令人鼓舞的進(jìn)展嫁盲，這種方法潛在地可以避免插入性突變引起的問(wèn)題，并在內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制下保留野生型基因序列烈掠。

總之羞秤，本文所描述的最有希望的結(jié)果都是在過(guò)去十年中取得的。通過(guò)在某些組織中建立了概念驗(yàn)證左敌，并確定了其他組織中存在的問(wèn)題瘾蛋，該領(lǐng)域很可能能夠借助這些經(jīng)驗(yàn)充分發(fā)揮體內(nèi)基因遞送的潛力，為一系列遺傳性疾病提供更好的治療選擇矫限。