【案例】
使用雙酶切的方式將一段基因序列插入pDsRed2-N1質(zhì)粒中拣技，使其能夠與DsRED蛋白進(jìn)行融合表達(dá)篮绿。
【1. 序列導(dǎo)入】
pDsRed2-N1質(zhì)料ê矗可以直接在SnapGene的序列庫(kù)中找到儿普，導(dǎo)入方式在前面的文章中已經(jīng)介紹祖娘，這里不再贅述荚孵。從圖譜中選擇多克隆位點(diǎn)區(qū)域MCS妹窖，點(diǎn)擊，并轉(zhuǎn)到序列頁(yè)面：
同時(shí)收叶，新建DNA序列骄呼，將目的基因的序列粘貼進(jìn)去，用于后續(xù)的酶切位點(diǎn)分析判没。
敲黑板ｒ烟选！哆致！
【2.?酶切位點(diǎn)分析】
雙酶切連接的酶需要滿足以下要求：
一绕德、酶切位點(diǎn)需要存在于MCS中，但同時(shí)不能存在于目的基因序列中摊阀。
二耻蛇、兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間至少要有幾個(gè)堿基間隔，不能緊鄰或重疊胞此。
三臣咖、最好選擇成熟的內(nèi)切酶。
四漱牵、結(jié)合實(shí)驗(yàn)室酶庫(kù)夺蛇，最好保證內(nèi)切酶能在同一最佳緩沖液進(jìn)行反應(yīng)
五、雙酶切后末端不會(huì)發(fā)生自連
按照以上原則酣胀，我們先看基因中的常見(jiàn)酶切位點(diǎn)：
然后在MCS中排除這些酶切位點(diǎn)：
之后在剩下的酶切位點(diǎn)中刁赦，選擇常用的即可娶聘，因?yàn)镠indIII、EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)靠的太近甚脉，沒(méi)有選擇這兩個(gè)的組合丸升，以免造成雙酶切的效率下降。因此牺氨，最終選擇的是EcoRI+KpnI的酶切組合狡耻。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反應(yīng)緩沖液不一樣猴凹，查看EcoRI酶和KpnI酶的TAKARA雙酶切體系夷狰，推薦使用TAKARA的M緩沖液。
【3. 調(diào)整融合表達(dá)的閱讀框】
因?yàn)槟康幕蛐枰诤舷掠蔚臒晒獾鞍走M(jìn)行示蹤郊霎，所以調(diào)整閱讀框的通順性是非常重要的沼头，首先將目的基因中的終止密碼子去除，然后將載體上EcoRI+KpnI之間的序列替換為去除終止密碼子之后的目的基因的序列：
觀察目的基因向下游表達(dá)至DsRed2中的氨基酸序列（HGL）书劝，發(fā)現(xiàn)與DsRed2原始序列（MAS）不同瘫证，即發(fā)生了移碼，完整的閱讀框遭到了破壞庄撮。因此背捌，我們需要在目的基因下游與KpnI之間添加堿基恢復(fù)其閱讀框的正確。
從上圖中可以看出洞斯，當(dāng)添加了兩個(gè)堿基之后毡庆，之前的兩個(gè)不同的氨基酸序列合二為一，變?yōu)檎_的序列烙如，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因進(jìn)行正確的融合表達(dá)了么抗。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能區(qū)，去掉一個(gè)堿基同樣可以修復(fù)閱讀框)
