Davie K, Jacobs J, Atkins M, Potier D, Christiaens V, Halder G, Aerts S. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 2015 Feb 13;11(2):e1004994. doi: 10.1371/journal.pgen.1004994. PMID: 25679813; PMCID: PMC4334524.

增強子通過招募與之相結(jié)合的特定的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因的時空表達塌忽，當轉(zhuǎn)錄因子與活躍調(diào)控區(qū)相結(jié)合的時候终惑，相應(yīng)區(qū)域的開放性增強饲鄙，變成開放染色質(zhì)區(qū)谬以，從而調(diào)控基因的表達强饮。那是否可以通過染色質(zhì)開放性分析的方法對比正常生長的組織與處理的組織，借此尋找組織特異性表達相關(guān)調(diào)控區(qū)域呢为黎？

2015年邮丰，PLos Genetics發(fā)表文章《Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo TumorDevelopment by ATAC-seq and FAIRE-seqOpen Chromatin Profiling》行您，作者就是以此為思路，利用ATAC-seq與FAIRE-seq的方法進行染色質(zhì)開放性分析剪廉，通過對比野生型與不同腫瘤組織娃循，并進一步鑒定出于與之相關(guān)調(diào)控區(qū)域與調(diào)控元件。

研究結(jié)果

1斗蒋、ATAC-seq淮野、 FAIRE-seq都能很好的鑒定出已知的增強子

黑腹果蠅的眼盤作為一種研究基因時空表達與細胞分化的模式系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。作者同樣選擇了黑腹果蠅的眼盤為研究材料進行后續(xù)實驗吹泡。首先利用兩個已被驗證的增強子Optix? 和oculis (so) 來對比ChIP-seq骤星、DNAse-seq、ATAC-seq與FAIRE-seq四種方法的優(yōu)良差異爆哑。結(jié)果顯示在眼觸角組織中洞难，ATAC-seq、 FAIRE-seq都能很好的鑒定出兩種已知的增強子揭朝，而在胚胎組織中队贱，DNAse-seq并未檢測出 (Fig. 1)。ATAC-seq與FAIRE-seq兩種方法的 peak called 高度重疊潭袱，且相應(yīng)峰高有著很強的相關(guān)性（Fig2A--D）柱嫌。作者進一步驗證了ATAC-seq與FAIRE-seq兩種方法在鑒定啟動子、增強子屯换、絕緣子方面的都能發(fā)揮相應(yīng)作用（Fig2E--G）编丘，兩種方法對較，發(fā)現(xiàn)ATAC-seq方法的效果更加顯著彤悔。

Fig 1. Enhancer identification in the eye primordium by ATAC-seq and FAIRE-seq. (?通過ATAC-seq和FAIRE-seq識別眼睛原基中的增強子 )

Fig 2. Comparing general features of ATAC-seq and FAIRE-seq.（?ATAC-seq和FAIRE-seq 的基本特征比較）

2嘉抓、ATAC-seq技術(shù)在染色質(zhì)的開放性分析、被保護核小體鑒定等方面作用獨特

在以CTCF為研究對象驗證絕緣子過程中晕窑，ATAC-seq也可應(yīng)用于解析轉(zhuǎn)錄因子足跡和核小體包裝（Fig3）抑片。在以往的研究中，在CTCF結(jié)合區(qū)域杨赤，ATAC-seq的信號降低敞斋，作者想要驗證這種現(xiàn)象是否也存在于果蠅眼睛的形成中，作者發(fā)現(xiàn)在剪切位點上疾牲，CTCF的覆蓋度明顯下降植捎，這表明，雖然這些區(qū)域通常都是開放的说敏，但是CTCF保護蛋白阻止了其被切割鸥跟，進一步闡明丢郊，高精度的ATAC-seq在鑒定調(diào)控區(qū)域中將會發(fā)揮重大作用盔沫。根據(jù)以往在體外對人體染色質(zhì)的研究，ATAC-seq可以關(guān)聯(lián)切割位點與核小體之間的距離，于是作者就評估是否對果蠅體內(nèi)的小的樣品進行ATAC-seq也可以獲得相應(yīng)信息递览。通過對比Buenrostro et al.的研究狗超，作者驚喜的發(fā)現(xiàn)，即使在低至0.5M的reads讀數(shù)的情況下谴忧，ATAC-seq依舊可以獲得準確的結(jié)果很泊。通過以上實驗，證明了ATAC-seq技術(shù)在染色質(zhì)的開放性分析沾谓、被保護核小體鑒定等諸多方面發(fā)揮了獨特的作用委造。

Fig 3. Recovery of known enhancers and CTCF footprinting by ATAC-seq. （通過ATAC-seq驗證已知增強子和CTCF足跡）

3、ATAC-seq均驶、 FAIRE-seq可以鑒定腫瘤組織與野生組織中染色質(zhì)開放性的變化

鑒于ATAC-seq昏兆、 FAIRE-seq的強大功能，作者以野生型與RasV12; scrib-/-癌癥模式（致癌蛋白Ras過表達與scrib-/-隱形純合突變）為材料進行研究妇穴，并通過對比早期腫瘤（RSE）爬虱、晚期腫瘤（RSL）與野生型開放染色質(zhì)的差別，ATAC-seq結(jié)果顯示有4851個峰的極速增加與4984個峰的降低腾它。而且跑筝， ATAC-seq的結(jié)果相對于FAIRE-seq而言，變化更加劇烈瞒滴，更加精細曲梗。通過信息分析，上調(diào)表達的基因與染色質(zhì)區(qū)域的開放緊密相關(guān)妓忍，下調(diào)的基因與染色質(zhì)開放度下降的區(qū)域相關(guān)稀并。這就表明染色質(zhì)區(qū)域的開放與關(guān)閉與整個基因功能的表達關(guān)系密切。作者以p53內(nèi)的一個未知增強子為例證明了這個現(xiàn)象（Fig4）单默〉饩伲總的來說，通過ATAC-seq搁廓、 FAIRE-seq可以鑒定腫瘤組織與野生組織中染色質(zhì)開放性的變化引颈，并且許多內(nèi)源性的增強子和啟動子的改變與基因的表達密切相關(guān)。

Fig 4. The tumor chromatin landscape. (腫瘤染色質(zhì)圖譜)

4境蜕、不同開放染色質(zhì)對腫瘤發(fā)生的調(diào)控過程具有重要作用

已經(jīng)獲得調(diào)控區(qū)域的確切位置蝙场，作者利用i-cisTarget分析軟件對9713個候選的轉(zhuǎn)錄因子motifs進行篩選，獲得了AP-1粱年、 Stat92E售滤、 Scalloped、Zelda和? Brf.,其中AP-1和Stat92E兩個TFmotifs 作為兩個主要的調(diào)控元件。在活躍但并未改變的調(diào)控區(qū)完箩，Stat92E并未富集而AP-1也只是微量富集（NES=2.7）赐俗，這就表明富集只是特定發(fā)生于活性改變了的調(diào)控區(qū)域。引人注目的是弊知，在誘導(dǎo)腫瘤生成的調(diào)控區(qū)阻逮，AP-1大量匹配（81%），這就意味著其在腫瘤生成中的誘發(fā)作用秩彤。AP- 1在JNK去磷酸化下游活躍叔扼，多個實驗室已經(jīng)證明在RasV12; scrib-/-腫瘤的發(fā)展過程中JNK與AP-1的重要性，抑制JNK信號或者敲除AP-1 都可以阻斷腫瘤的擴張漫雷。Stat92E motif富集于較少的調(diào)控區(qū)而且高度覆蓋了AP-1的應(yīng)答區(qū)瓜富，這與已知的RasV12; scrib-/-化是一個協(xié)同的通路不謀而合（Fig5A、B）降盹。

隨后作者將野生型與不同腫瘤發(fā)育時期的活躍染色質(zhì)區(qū)進行對比食呻，探究是否隨著腫瘤的發(fā)展，這些區(qū)域是否更加活躍澎现。并根據(jù)不同的增強子開放程度講增強子分成四組：Upd組（Upd過表達后開放的增強子）仅胞、Stable組（穩(wěn)定開放的增強子）、ALL組（所有開放的增強子）剑辫、Gradual組（逐步開放的增強子）干旧。作者發(fā)現(xiàn)，在Stable組妹蔽，State92E富集高且高于AP-1椎眯，而在Gradual組，AP-1富集更加顯著（Fig5C）胳岂。作者對這種現(xiàn)象也做出了一定的假設(shè)编整，一方面可能是因為State92E靶標活化早于AP-1或者小部分入侵的腫瘤也仍然具有State92E 活性∪榉幔總的來說掌测，在腫瘤發(fā)育時期基于不同開放染色質(zhì)峰的motif分析推理提供了一個有效的途徑來對腫瘤發(fā)生的調(diào)控過程的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進行研究，本篇作者所得到的結(jié)果也證明了AP-1與State92E在RasV12; scrib-/-誘導(dǎo)腫瘤形成的下游發(fā)揮了重要作用产园。

Fig 5. Regulator detection by motif inference. （通過motif推斷的調(diào)控過程）

5汞斧、StateE92在腫瘤化過程中發(fā)揮了重要作用

?作為JAK/STAT 信號通路的效應(yīng)子，Stat92E被證明參與了改變?nèi)旧|(zhì)區(qū)域的過程什燕。以往研究也顯示當阻斷JAK/STAT 信號通路粘勒，腫瘤癥狀被減少。然而Stat92E是如何直接參與這個過程的并沒有被證實屎即。作者構(gòu)建了一個State92E突變的RasV12; scrib-/-腫瘤庙睡，發(fā)現(xiàn)腫瘤增長減慢（Fig6A--C）事富，而且，State92E喪失功能的幼蟲甚至化蛹乘陪，這在以往的實驗中是從未出現(xiàn)统台。隨后作者超激活JAK/STAT 信號通路，并將獲得的材料命名為Upd暂刘。通過對比誘導(dǎo)腫瘤形成導(dǎo)致的染色質(zhì)開放性變化與過表達JAK/STAT 信號通路饺谬，發(fā)現(xiàn)這些變化大部分具有相同的方向捂刺，但是過表達所引起的染色質(zhì)開放性改變相較于誘導(dǎo)腫瘤生成較弱谣拣。利用ATAC-seq，誘導(dǎo)腫瘤生成的處理中檢測的356個調(diào)控區(qū)族展，在過表達Upd中森缠，72% 也有正向調(diào)控，說明這些調(diào)控區(qū)是State92E的效應(yīng)區(qū)仪缸。而剩下的28%作者認為贵涵，這部分是AP-1的調(diào)控區(qū)，State92E在其中不發(fā)揮作用恰画。隨后作者想要知道這些調(diào)控區(qū)域的改變是否直接影響了基因的表達宾茂，作者在State92E的效應(yīng)調(diào)控區(qū)上下游5Kb的范圍內(nèi)確定了28個潛在的目的基因。這其中有至少七個基因在JAK/STAT 信號通路發(fā)揮了重要作用（Fig6D--F）拴还。由此跨晴，作者認為StateE92在腫瘤化過程中發(fā)揮了重要作用。

Fig 6. Validation of Stat92E as a key regulator during Ras V12 ; scrib -/- oncogenesis. （驗證Stat92E作為Ras V12關(guān)鍵調(diào)控因子片林，- / -腫瘤形成）

6端盆、總結(jié)

這篇文章一方面揭示了ATAC-seq、FAIRE-seq在開放染色質(zhì)分析中的強大作用费封，尤其ATAC-seq方法更展現(xiàn)出更強的優(yōu)越性焕妙，無論其更高 的信噪比、以及在轉(zhuǎn)錄因子足跡鑒定弓摘、轉(zhuǎn)錄因子鑒定等方面都展現(xiàn)出其獨特優(yōu)勢焚鹊。同時利用ATAC-seq鑒定了State92E、AP-1在腫瘤生成中的重要作用韧献，進一步闡述了腫瘤生成的機理寺旺，為腫瘤研究提供了寶貴經(jīng)驗。

測序數(shù)據(jù)

ATAC-seq, ChIP-seq and FAIRE-seq data for all conditions are available in GEO (http://www.

ncbi.nlm.nih.gov/geo/), with accession number GSE59078.

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參考鏈接：http://www.igenebook.com/news/376.html