基因敲除是指使生物體基因組中的特定基因失活或失效的過(guò)程。通常是通過(guò)在靶基因中引入突變來(lái)實(shí)現(xiàn)的吩蔑，使其失去功能体谒。進(jìn)行基因敲除的方法，包括同源重組翻默、RNA干擾（RNAi）和CRISPR/Cas9缸沃。同源重組即通過(guò)引入修飾的DNA片段，用無(wú)功能或被破壞的版本替換靶基因修械；RNAi利用小RNA分子來(lái)沉默或降解靶基因的信使RNA（mRNA）趾牧，阻止其翻譯為蛋白質(zhì)；CRISPR/Cas9是一種革命性的基因編輯工具肯污，它使用引導(dǎo)RNA（sgRNA）和Cas9酶在基因組的特定位置引入靶向DNA斷裂翘单，導(dǎo)致基因破壞。
基因敲除的sgRNA如何設(shè)計(jì)蹦渣？
在 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中哄芜，sgRNA（small guide RNA，sgRNA）通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則引導(dǎo) Cas9 蛋白酶 至基因組特定的靶序列上柬唯，Cas9 蛋白與 PAM 序列結(jié)合后便可對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割认臊，形成 DNA 雙鏈切口。sgRNA 設(shè)計(jì)的合理與否锄奢，對(duì)于 CRISPR-Cas9 編輯系統(tǒng)的切割效率失晴，甚至最后能否得到 KO 細(xì)胞具有重要影響。
目前雖然有諸多高效快速的 gRNA 設(shè)計(jì)工具拘央，但我們?nèi)孕枇私饣镜脑O(shè)計(jì)原則才能更好地做出判斷师坎。sgRNA 的設(shè)計(jì)需要遵循以下原則：
(1) 不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因堪滨。挑選靶區(qū)域時(shí)應(yīng)避免選擇與其他基因重疊的區(qū)域，且能影 響蛋白的功能結(jié)構(gòu)域蕊温。
(2) 盡可能影響所有的轉(zhuǎn)錄本袱箱，敲除位點(diǎn)最好在編碼區(qū)的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外顯子或 ATG 之 前的外顯子义矛。
(3) 片段敲除的 sgRNA 設(shè)計(jì)在內(nèi)含子上发笔，這樣能敲除整個(gè)外顯子區(qū)，避免翻譯出殘留蛋白凉翻。敲除區(qū)域前后 序列盡量簡(jiǎn)單了讨，方便后續(xù)的 PCR 鑒定。同時(shí)敲除的外顯子編碼序列之和為非 3 的倍數(shù)，使靶區(qū)域后面 的序列發(fā)生移碼前计。另外胞谭，片段敲除所選定的敲除區(qū)域不要超過(guò) 10 Kb，超過(guò) 10 Kb 后編輯敲除效率會(huì)降低男杈。
(4) 在設(shè)計(jì) sgRNA 時(shí)要綜合考慮候選編輯位點(diǎn)的序列丈屹、位置、正負(fù)鏈伶棒、GC 含量旺垒、潛在的脫靶位點(diǎn)等信息。例如靶點(diǎn)的 GC%盡量不要低于 40%肤无，靶點(diǎn)序列 GC%偏高（50%~70%）有較高的打靶效率先蒋；靶點(diǎn)內(nèi)不 要有連續(xù) 4 個(gè)以上的 T 堿基，避免形成 RNA Pol III 的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等宛渐。
(5) 當(dāng)敲除可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖非常緩慢或停止生長(zhǎng)竞漾，或在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的 cell pool 階段檢測(cè)效率呈顯著下 降趨勢(shì)，即可判定可能出現(xiàn)敲除致死的情況皇忿，建議用 RNAi畴蹭。
(6) 由于存在部分強(qiáng)功能蛋白，即使表達(dá)下調(diào)了鳍烁，仍然有較強(qiáng)的功能叨襟，如果 RNAi 始終做不出表型，但從有 關(guān)信息推測(cè)這個(gè)基因很大可能性會(huì)出表型幔荒，建議做 KO糊闽；另外，研究的目的基因處于非轉(zhuǎn)錄區(qū)域爹梁，或者 目的基因有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率右犹，也是無(wú)法用 RNAi 進(jìn)行有效干擾的，則建議做 KO姚垃，且 KO 細(xì)胞更適合進(jìn) 行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)念链。
?(7) 最后，敲低跟敲除不是二選一的關(guān)系积糯。當(dāng)我們用 RNAi 做了基因敲低掂墓，觀察到細(xì)胞表型的變化后，仍然 可以進(jìn)一步做敲除看成，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)論更加有說(shuō)服性君编。
如何避免脫靶效應(yīng)？
研究表明川慌，sgRNA 通常會(huì)與基因組 DNA 發(fā)生一定概率的序列錯(cuò)配吃嘿，從而引起非預(yù)期的基因組編輯祠乃，即 所謂的脫靶效應(yīng)（Off-target effects）。為了盡可能避免脫靶效應(yīng)兑燥，可以通過(guò)以下幾點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化：
(1) 提高 sgRNA 特異性亮瓷。在設(shè)計(jì) sgRNA 序列時(shí)，可選擇 GC 含量在 50%~70%贪嫂，與靶基因序列之外的基因 組 DNA 同源性較低的 sgRNA 序列寺庄，同時(shí)還可以選擇在 sgRNA 的 5’端增加 2 個(gè)鳥(niǎo)嘌呤，來(lái)提高 sgRNA 的特異性力崇。
(2) 控制 Cas9-sgRNA 用量斗塘。通過(guò)控制 Cas9 蛋白或 sgRNA 的表達(dá)量來(lái)減少脫靶效應(yīng)，細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) Cas9 將增加脫靶風(fēng)險(xiǎn)亮靴，因此可以通過(guò) Cas9 蛋白的抑制劑來(lái)降低 Cas9 活性馍盟，降低脫靶效應(yīng)。盡管通過(guò)調(diào)節(jié) sgRNA 和 Cas9 濃度可降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)茧吊，但濃度降低后贞岭，相應(yīng)的基因組編輯能力也會(huì)減弱，要根據(jù)實(shí)際情 況選擇合適的 gRNA 和 Cas9 復(fù)合物比值搓侄。
(3) 改造 Cas9瞄桨。通過(guò)對(duì)野生型 Cas9 進(jìn)行改造提高 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的特異性，可將 Cas9 中的一個(gè)酶切位 點(diǎn)失活讶踪，得到突變型切口酶芯侥，由于突變型 Cas9 只能對(duì)單鏈進(jìn)行切割，因此需要 2 條 sgRNA 同時(shí)引導(dǎo)乳讥， 在 DNA 不同的鏈產(chǎn)生 2 個(gè)相近的切口柱查，才能引起雙鏈 DNA 斷裂。只有 2 條 sgRNA 均發(fā)生錯(cuò)配時(shí)才會(huì) 發(fā)生脫靶云石，這極大降低了脫靶效應(yīng)唉工。
(4) 選擇合適的遞送載體。目前 Cas9 可以通過(guò) DNA 質(zhì)粒汹忠、病毒和蛋白質(zhì)三種方式傳遞到靶細(xì)胞中淋硝，利用 Cas9/sgRNA 核糖核蛋白（ribonucleoproteins，RNPs）遞送系統(tǒng)不會(huì)在被編輯的細(xì)胞基因組中插入外源 DNA 序列宽菜，可有效減少脫靶效應(yīng)奖地。
如何檢測(cè)脫靶？
一直以來(lái)赋焕，CRISPR 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)尚未得到有效的解決，因此對(duì)于脫靶效率的檢測(cè)也有不少研究仰楚。
針對(duì)細(xì)胞外的檢測(cè)方法有：
(1) Digenome-seq Digested genome sequencing隆判，通過(guò) Cas9 核酸酶體外切割后提基因組 DNA犬庇，進(jìn)行高通量測(cè) 序，鑒定脫位點(diǎn)侨嘀，生物信息學(xué)分析來(lái)檢測(cè)脫靶情況臭挽。
(2) CIRCLE-seq，將基因組片段化之后自連接環(huán)化咬腕，然后用 Cas9 復(fù)合物處理將提取的 DNA 斷裂成 300 bp 后再環(huán)化欢峰，加入 gRNA 和 Cas9，含有靶標(biāo)序列的環(huán)形 DNA 會(huì)被切割成線性 DNA涨共，再對(duì)線性的 DNA 進(jìn)行高通量測(cè)序纽帖。
(3) SITE-Seq，在細(xì)胞外將 DNA 在 sgRNPs 處理后進(jìn)行高通量測(cè)序举反，該技術(shù)使用了 sgRNA 編程的 Cas9 對(duì) 基因組 DNA 中的剪切位點(diǎn)序列進(jìn)行識(shí)別懊直。
細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)方法有：
(1) GUIDE-seq，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò) Cas9 切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后火鼻，以非同源性末端接合的方法室囊，引入一段短雙鏈 寡核苷酸來(lái)標(biāo)記 CRISPR-Cas9 誘導(dǎo)的脫靶斷裂，高通量測(cè)序確定脫靶位置魁索。
(2) DISCOVER-Seq融撞，利用 DNA 修復(fù)因子結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀和高通量測(cè)序的方法，可以識(shí)別出 CRISPR 在基因組中切割的的確切位置粗蔚。
(3) GOTI尝偎，利用雙細(xì)胞胚胎注射 RNA 和 Cas9 來(lái)評(píng)估脫靶效應(yīng)。用流式細(xì)胞技術(shù)分選出小鼠胚胎基因編輯 細(xì)胞和未編輯細(xì)胞支鸡，全基因組測(cè)序進(jìn)行差異比較分析冬念。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性檢測(cè)方法有哪些?
通常我們都是采用各個(gè)設(shè)計(jì)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，得到我們的 gRNA牧挣，那如何能夠快速急前、準(zhǔn)確的驗(yàn)證 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是否能發(fā)揮作用呢？
(1) 熒光活性檢測(cè)法瀑构。在 Cas9 和 gRNA 的作用下裆针，靶點(diǎn)位置的雙鏈 DNA 會(huì)被切割形成 DSB，細(xì)胞通過(guò)同 源重組形成有活性的熒光蛋白寺晌，可通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)熒光強(qiáng)度是否增強(qiáng)世吨，以此來(lái)判斷 Cas9 及 gRNA 的活性及敲除效率。
(2) 錯(cuò)配酶法呻征。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中耘婚，會(huì)形成含有錯(cuò)配的 DNA 雙鏈，將經(jīng)過(guò)錯(cuò)配酶切 割后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳陆赋，檢測(cè) CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的切割活性沐祷。
(3) 套峰檢測(cè)法嚷闭。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行 PCR 并測(cè)序，通過(guò)分析 Spacer 區(qū)域套峰情況來(lái)分析 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的活性赖临。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性檢測(cè)方法有哪些?
通常我們都是采用各個(gè)設(shè)計(jì)網(wǎng)站預(yù)測(cè)胞锰，得到我們的 gRNA，那如何能夠快速兢榨、準(zhǔn)確的驗(yàn)證 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是否能發(fā)揮作用呢嗅榕？
(1) 熒光活性檢測(cè)法。在 Cas9 和 gRNA 的作用下吵聪，靶點(diǎn)位置的雙鏈 DNA 會(huì)被切割形成 DSB凌那，細(xì)胞通過(guò)同 源重組形成有活性的熒光蛋白，可通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)熒光強(qiáng)度是否增強(qiáng)暖璧，以此來(lái)判斷 Cas9 及 gRNA 的活性及敲除效率案怯。
(2) 錯(cuò)配酶法。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中澎办，會(huì)形成含有錯(cuò)配的 DNA 雙鏈嘲碱，將經(jīng)過(guò)錯(cuò)配酶切 割后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè) CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的切割活性局蚀。
(3) 套峰檢測(cè)法麦锯。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行 PCR 并測(cè)序，通過(guò)分析 Spacer 區(qū)域套峰情況來(lái)分析 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的活性琅绅。
基因敲除的主要技術(shù)手段扶欣、技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)
總結(jié)：蛋白法不需要構(gòu)建載體，最快捷千扶，但gRNA容易降解料祠、操作需要十分小心。常規(guī)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒法構(gòu)建簡(jiǎn)單澎羞，但是效率低髓绽。病毒法效率高，但是周期長(zhǎng)妆绞，成本更高顺呕。
