【導(dǎo)入】
基于熒光素酶（Luciferase）的發(fā)光原理榆芦，形成了雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)惠豺。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海參熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可與各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光壶熏，產(chǎn)生的熒光值即表示兩種酶的表達(dá)量多少悲伶。
圖片來源[1]
Firefly luciferase和Renilla luciferase被稱為報告基因，是因?yàn)樵诒磉_(dá)調(diào)控研究時二跋，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可監(jiān)控微觀層面上的分子間相互作用。
具體做法：將靶基因的的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5'啟動子區(qū)融合在Firefly luciferase基因的上游流昏，把3‘-UTR區(qū)或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游扎即，以研究啟動子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用吞获，或miRNA對目的基因/IncRNA的調(diào)控作用。
該系統(tǒng)中引入Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參谚鄙，以消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染等因素帶來的組間誤差各拷。
其中l(wèi)uciferase來源于細(xì)菌、螢火蟲和發(fā)光海洋生物等闷营，可以在哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞中直接表達(dá)烤黍，無需表達(dá)后修飾，直接具備完全酶活性傻盟。
與GFP不同之處在于luciferase的發(fā)光檢測不需要激發(fā)光激發(fā)速蕊，且發(fā)光穿透力更強(qiáng)，這使得Luc實(shí)驗(yàn)具備可定量娘赴、高靈敏度及背景低等特點(diǎn)规哲。
【利用熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證植物蛋白互作】
基本原理
在驗(yàn)證植物蛋白互作時，熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高靈敏度诽表、可定量化唉锌、操作簡單高效被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)和動物學(xué)蛋白質(zhì)互作研究[2]。
圖片來源[2]
目前, 應(yīng)用最為廣泛的熒火素酶基因來源于北美螢火蟲 (firefly luciferase), 該基因編碼550個氨基酸組成的熒火素酶蛋白 (大小為62 kDa)关顷。
實(shí)驗(yàn)中, 熒光素酶蛋白被切成N端和C端2個功能片段, 即NLuc (2–416AA)和 CLuc (398–550AA)糊秆。
在一個實(shí)驗(yàn)體系中, 待檢測的2個目標(biāo)蛋白分別與NLuc和CLuc融合, 如果2個目標(biāo)蛋白相互作用, 則熒火素酶的NLuc和CLuc在空間上會足夠靠近并正確組裝, 從而發(fā)揮熒火素酶活性, 即分解底物產(chǎn)生熒光 。
實(shí)驗(yàn)過程
將含有融合蛋白的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 (Agrobacterium) 后注射煙草葉片议双。24–48小時后痘番，加入反應(yīng)底物熒火素, 利用植物活體分子影像系統(tǒng) (CCD imaging system) 或luminometer來定性定量檢測熒光強(qiáng)度, 以判定目標(biāo)蛋白之間是否存在相互作用及互作的程度。
載體圖譜
圖片來源：pCAMBIA-CLuc_crisprbio.cn
