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研究概述：

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝紊亂内狸，PCOS患者免疫細(xì)胞的功能障礙可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的持續(xù)刺激检眯，增加促炎細(xì)胞，從而復(fù)發(fā)性植入失斃サ（RIF）

本研究旨在探索PCOS和RIF發(fā)展中涉及的潛在生物標(biāo)志物和潛在途徑轰传。作者從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了3個(gè)PCOS和RIF數(shù)據(jù)集，通過WGCNA瘪撇、功能富集分析和三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析差異表達(dá)基因和模塊基因获茬，從而確定了2個(gè)診斷基因GLIPR1和MAMLD1。接著使用ROC曲線評(píng)估PCOS和RIF驗(yàn)證數(shù)據(jù)集倔既。最后收集了健康和PCOS不孕婦女的顆粒細(xì)胞以及健康和RIF患者的子宮內(nèi)膜組織恕曲，采用RT-PCR驗(yàn)證GLIPR1和MAMLD1的可靠性。此外渤涌，通過GSEA和免疫浸潤(rùn)佩谣，發(fā)現(xiàn)PCOS和RIF患者都存在與TCA循環(huán)相關(guān)的代謝物紊亂，最終導(dǎo)致免疫細(xì)胞的大量激活实蓬。

研究結(jié)果：

一茸俭、差異表達(dá)基因DEGs的鑒定

1. 作者在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇GSE10946和GSE34526為PCOS的發(fā)現(xiàn)隊(duì)列吊履，GSE103465和GSE111974為RIF的發(fā)現(xiàn)隊(duì)列。表1是四個(gè)數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息调鬓。此外艇炎，GSE80432和GSE26787分別為PCOS和RIF的驗(yàn)證隊(duì)列。本研究中將這兩個(gè)疾病組簡(jiǎn)稱為PCOS和RIF腾窝。

2. 在生物信息分析之前測(cè)試了數(shù)據(jù)集缀踪，發(fā)現(xiàn)兩種疾病的批量效應(yīng)明顯(圖2A、E)虹脯，故使用“sva”包剔除了PCOS組(圖2B)和RIF組(圖2F)的批量效應(yīng)驴娃，得到了可靠的分析結(jié)果。

3. 使用LIMMA包來表征兩組之間的DEGs循集。

PCOS(圖2C)上調(diào)基因101個(gè)唇敞，下調(diào)基因100個(gè)；

RIF(圖2G)上調(diào)基因167個(gè)咒彤，下調(diào)基因86個(gè)疆柔。

4. 圖2D, H通過熱圖顯示兩組中所含的DEGs。

二蔼紧、WGCNA對(duì)關(guān)鍵模塊的篩選

1. 本研究采用WGCNA方法構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

2. 在PCOS組中，確定了20個(gè)共表達(dá)模塊狠轻，P<0.05的模塊視為關(guān)鍵模塊奸例。圖3C，antiquewhite4模塊正相關(guān)最強(qiáng)向楼，包含180個(gè)基因查吊。

3. 同樣將WGCNA應(yīng)用于RIF組，共鑒定出19個(gè)模塊：dark grey, dark green, 和royal blue模塊呈強(qiáng)正相關(guān)湖蜕，green-yellow, salmon, dark turquoise, 和light yellow模塊呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(圖3E逻卖、F)。

4. 在RIF組這7個(gè)關(guān)鍵模塊的基因中昭抒，作者進(jìn)一步篩選出了334個(gè)|MM| > 0.8和|GS| > 0.5的基因评也，可能被用作候選的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記。

三灭返、共享基因分析與功能富集

1. 圖4A：PCOS和RIF的DEGs共有11個(gè)基因重疊盗迟，圖4B：只有一個(gè)基因與WGCNA分析的基因重疊，圖4C：這12個(gè)基因可能與PCOS和RIF的發(fā)病機(jī)制有關(guān)熙含，且具有共享關(guān)系罚缕。

2. GO對(duì)共享基因的分析顯示，它們?cè)谂c早期胚胎器官形態(tài)發(fā)生相關(guān)的途徑中被過度代表怎静。此外T細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)邮弹、肥大細(xì)胞激活和白細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等生物過程途徑顯著富集黔衡，表明免疫細(xì)胞的激活和凋亡可能在PCOS和RIF的共同發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。KEGG富集與GO分析一致 (圖4D, E) 腌乡。

3. 此外盟劫，與卵泡發(fā)育相關(guān)的幾種通路被富集，如p53信號(hào)通路导饲、FOXO信號(hào)通路捞高、hippo信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路。

四渣锦、基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法（LASSO硝岗，SVM-RFE和隨機(jī)森林）識(shí)別潛在的共享診斷基因

1. 在PCOS組中，基于LASSO發(fā)現(xiàn)了8個(gè)基因袋毙。將上述12個(gè)基因輸入RF分類器型檀，在重要性量表上顯示前10個(gè)基因，選擇0.9作為重要篩選閾值听盖，共鑒定出9個(gè)基因(圖5B)胀溺。

2. SVM算法識(shí)別出5 個(gè)基因，其5點(diǎn)CV誤差最低皆看，準(zhǔn)確度最高(圖5C)仓坞。

3. 通過這三種算法結(jié)果的交集，為PCOS組開發(fā)了5種共享生物標(biāo)志物(CHST11, GLIPR1, SLC16A6, MAMLD1, HAPLN1, GAS1)(圖5D, I)腰吟。

4. 同樣无埃，當(dāng) LASSO 分析RIF組獲得7個(gè)特征基因(圖5E)。圖5F顯示重要性量表上排名前10的基因毛雇，選擇重要性>0.9的9個(gè)基因作為RM結(jié)果嫉称。

5. 使用SVM-REF算法鑒定10個(gè)樞紐基因的子集(圖5G)。這三種算法交集灵疮，為RIF組開發(fā)了7種共享生物標(biāo)志物 (圖5H, I)织阅。

五、診斷基因的預(yù)測(cè)價(jià)值和有效性

1. PCOS和RIF組的機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)果進(jìn)行交集震捣，得到2個(gè)共享的診斷基因GLIPR1和MAMLD1(圖6A)荔棉。

2. 圖6B顯示GLIRP1在RIF組中表達(dá)水平較低，在PCOS組中較高蒿赢；MAMLD1在兩組的表達(dá)均較低(圖6F)江耀。

3. 圖6C, G采用ROC分析，兩種靶基因?qū)煞N疾病診斷的預(yù)測(cè)性能都很穩(wěn)健诉植。

4. 圖6D通過外部驗(yàn)證祥国，證實(shí)了GLIPR1和MAMLD1作為PCOS和RIF核心診斷基因的可靠性：兩個(gè)驗(yàn)證組中基因表達(dá)水平與發(fā)現(xiàn)組中的表達(dá)水平相匹配(圖6H、E、I)舌稀。

六啊犬、診斷基因的單基因GSEA

1. 分別對(duì)PCOS和RIF數(shù)據(jù)集中的兩種生物標(biāo)志物進(jìn)行了單基因GSEA分析，并通過“GSEA”軟件包可視化前5個(gè)上調(diào)和下調(diào)通路壁查。

2. 圖7顯示觉至，在兩種疾病組中，這兩個(gè)基因都參與了甘氨酸睡腿、絲氨酸语御、蘇氨酸代謝、α -亞麻酸代謝席怪、丙酸代謝等代謝途徑应闯。此外都富集了與PCOS和RIF相關(guān)的炎癥相關(guān)通路。

七挂捻、共享診斷基因的免疫浸潤(rùn)分析

1. PCOS和RIF的特征是高免疫反應(yīng)碉纺，故采用CIBERSORT分析不同組免疫細(xì)胞豐度。在每組中刻撒，22個(gè)免疫細(xì)胞的比例以條形圖表示骨田。

2. 條形圖清楚地說明了PCOS（圖8A）和RIF（圖8E）之間T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞群的百分比的顯著差異声怔。與對(duì)照樣品相比态贤，PCOS樣品中活化的樹突狀細(xì)胞增加（圖8B），RIF樣品中醋火，NK靜止細(xì)胞悠汽，M0巨噬細(xì)胞增加，NK γδ細(xì)胞胎撇，樹突狀細(xì)胞活化減少（圖8F）介粘。

3. PCOS樣本中殖氏，GLIPR1與CD8 T細(xì)胞呈顯著正相關(guān)晚树，與M0巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖8C)。MAMLD1與記憶B細(xì)胞呈顯著正相關(guān)雅采，與M2巨噬細(xì)胞爵憎、靜息樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖8D)。

4. RIF樣本中婚瓜，GLIPR1與靜息NK細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(圖8G)宝鼓。MAMLD1與中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖8H)，可見免疫功能在PCOS和RIF的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要巴刻。

八愚铡、通過RT-PCR驗(yàn)證人體組織中的GLIPR和MAMLDs

對(duì)正常女性和PCOS患者的卵泡液來源的顆粒細(xì)胞，以及健康和RIF女性的子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行RT-PCR。與數(shù)據(jù)分析一致沥寥，PCOS患者顆粒細(xì)胞中的GLIPR1表達(dá)上調(diào)碍舍，MAMLD1表達(dá)降低（圖9A），而RIF患者子宮內(nèi)膜組織中GLIPR1和MAMLD1表達(dá)均降低（圖9B）邑雅。

研究總結(jié)：

本研究應(yīng)用WGCNA和三種機(jī)器學(xué)習(xí)方法片橡，鑒定了GLIPR2和MAMLD1作為疾病診斷標(biāo)志物的潛力，為PCOS和RIF患者的診斷和治療提供了新的臨床見解和指導(dǎo)淮野。此外捧书，通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)PCOS和RIF兩種疾病的共發(fā)病機(jī)制在于與TCA循環(huán)相關(guān)的許多代謝物的異常代謝，導(dǎo)致疾病組中免疫細(xì)胞的異常激活和免疫反應(yīng)骤星。