說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成拘领，侵刪。該課程由上海易算生物科技有限公司CEO沈誠頻博士所授冠句。
主要知識點(diǎn)：
--同位素對質(zhì)譜分析的影響
--原始譜圖的處理
--什么是b-y離子
回顧
在接著講今天的關(guān)鍵問題之前寂屏，我們先來列一下質(zhì)譜中相應(yīng)的一些單位（見下圖），可以幫助大家進(jìn)行更好的理解與記憶八秃。
這其中應(yīng)用最多的是原子質(zhì)量單位-道爾頓（Dalton or amu），其中的平均質(zhì)量數(shù)是以前質(zhì)譜分辨率不夠高時常用的一個概念（即不能將同位素峰區(qū)分開時肉盹，只能用平均質(zhì)量數(shù)來衡量）昔驱。
同位素的問題
上篇我們提到，在上面那個例子里上忍，794.03看起來不像是正確的原始同位素峰骤肛，而793.69才應(yīng)該是。大家看下面的圖窍蓝，是根據(jù)先前的數(shù)字列表提取出來的原始譜峰的信息腋颠。可以看到吓笙，794.03淑玫、793.69等是來自于同一個肽段的多個同位素峰。
形成這樣一個同位素峰的原因是，自然界中元素的組成是包含同位素的絮蒿，比如C的分子量是12.01尊搬，但其存在微量的半衰期非常長的C13，分子量要加1土涝。而O毁嗦、N、P等元素也都存在非常微量的同位素的峰回铛。
雖然狗准，平時看譜峰時會覺得其所占比例很小，覺得這些信號可能沒什么意義茵肃。但是在質(zhì)譜中會形成一系列的峰腔长。對于高分辨質(zhì)譜來說，這樣的峰很重要验残，它會用于后續(xù)的定性和定量分析捞附，因?yàn)檫@樣的信號強(qiáng)度會間接或者非等比的反映了肽段的信號強(qiáng)度或者說原始的量。
我們做SILAC或者非標(biāo)記定量處理的時候您没，這些信號都會用于后續(xù)的定量分析鸟召。因此在定量分析的軟件中，會將這些譜峰的強(qiáng)度全部用于后續(xù)的計算氨鹏，這也是為什么正確識別同位素峰分布是非常重要的欧募！
回到前面的問題，為什么我們認(rèn)為信號次強(qiáng)的793.69才應(yīng)該是零同位素峰仆抵，而信號最強(qiáng)的794.03反而不是呢跟继？
我們直觀的感受應(yīng)該是，峰最高的才是零同位素峰镣丑，對吧舔糖？但是，當(dāng)元素組成比較復(fù)雜或者說分子量比較大時莺匠，比如此圖中是帶有3電荷的肽段離子金吗，3乘以質(zhì)荷比793，得到質(zhì)量為差不多2400原始道爾頓數(shù)趣竣。這個分子量相對來說比較高了摇庙，也就是其含N、O期贫、H跟匆、C這些元素的數(shù)量是比較多的异袄，因此它的同位素組成比例會非常復(fù)雜通砍。在如此復(fù)雜的情況下，其原始的零同位素峰信號反而不是最強(qiáng)的。這也是很多時候質(zhì)譜采集錯信號的原因封孙。
關(guān)于同位素峰的問題迹冤，如果大伙兒還沒有想明白，我們再來展開聊一下虎忌。比如下圖中的同位素峰泡徙，對于一個分子量比較小的肽段離子，C13膜蠢、N15等同位素的比例是比較低的堪藐。
拿碳元素來舉例，C12在自然界中的比例是98.89%挑围，而C13只有1.11%礁竞。如果一個碳原子進(jìn)入質(zhì)譜儀，我們能看到的同位素峰就是兩個杉辙，C12峰的強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C13的峰模捂。
如果現(xiàn)在進(jìn)來一個離子含兩個C，那么它的同位素組合就有三種情況：2個C12蜘矢，1個C12和1個C13狂男，2個C13。因此它會多一個同位素峰品腹，即有三個同位素峰岖食。
再來，如果有100個C原子舞吭，以及20個N原子和10個H原子混合進(jìn)入質(zhì)譜儀县耽，那么同位素的排列組合將會非常多。我們用計算同位素分布的軟件可以得到镣典，隨著原子數(shù)的增加兔毙，零同位素峰的相對強(qiáng)度在漸漸變低。
也就是說兄春，我們的肽段越長澎剥，零同位素峰的信號就會越弱，當(dāng)100個碳原子進(jìn)入質(zhì)譜儀時赶舆，零同位素峰的相對強(qiáng)度從之前的99%降到了36.6%哑姚！反而，第一同位素峰的相對強(qiáng)度增加到36.9%芜茵，反而比零同位素峰還要高了叙量！
就像剛才我們舉的例子，雖然793.69的相對強(qiáng)度并不是最高的九串，但我們認(rèn)為它才應(yīng)該是零同位素峰绞佩，而不是相對強(qiáng)度最高的794.03寺鸥！在這種情況下，通常都很難依靠儀器和軟件正確識別零同位素峰品山，而是需要我們手工校正了胆建。
原始譜圖包含的信息
聊完了同位素的問題，接下來我們繼續(xù)講一級原始譜圖還包含哪些其它的重要信息肘交。
我們之所以可以用高壓液相色譜分離肽段笆载，就是肽段隨著其氨基酸組成的不同，或者說親疏水性不同涯呻，以及極性不同凉驻，因此在色譜上的保留時間是不一樣的。因?yàn)殡亩伍g的物理性質(zhì)上的差別复罐，我們才能夠用色譜柱對復(fù)雜的肽段混合物進(jìn)行分離沿侈。
因此，保留時間也是鑒定肽段的重要信息市栗。此信息還會進(jìn)一步用于諸如SILAC的定量缀拭、非標(biāo)記定量，以及下一代質(zhì)譜定量技術(shù)（比如DIA）填帽。因此我們色譜柱的質(zhì)量和性能蛛淋，對后續(xù)定性和定量分析的影響非常大。
以前篡腌，可能很多小伙伴認(rèn)為褐荷，一級質(zhì)譜中最重要的信息是分子量或者M(jìn)/Z。但隨著現(xiàn)在定量的要求越來越高嘹悼，intensity叛甫、保留時間這些信息都會越來越重要。對于高分辨質(zhì)譜來說杨伙，如果色譜分離肽段的效果夠好其监，那么我們可以解析出更多更復(fù)雜的中低豐度肽段。
另外限匣，色譜的分辨率或者說保留時間的區(qū)分度越高抖苦，色譜峰的寬度越窄，那么我們越可以將差別非常微小的肽段進(jìn)行有效的區(qū)分米死。這也是我們購買高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的原因之一锌历。
再有，SILAC和非標(biāo)記定量都會用到一級的強(qiáng)度信息及保留時間信息峦筒，下圖右側(cè)曲線的每一個小方塊點(diǎn)其實(shí)就是一次MS1的掃描究西，與左側(cè)圖對應(yīng)，一個強(qiáng)度值就是一個肽段物喷。我們看到出鋒的規(guī)律就是卤材，從某個時間點(diǎn)開始慢慢出峰遮斥，然后信號越來越強(qiáng)，出峰至最高點(diǎn)商膊，再慢慢變?nèi)醴ィ詈蠼Y(jié)束宠进。
我們對這樣一個過程中所有的信號進(jìn)行積分晕拆，就是基于MS1定量原理的一種計算方法。曲線圖的面積就是用于定量的基本信息材蹬，當(dāng)然還包括同位素峰实幕，需要對所有的同位素峰進(jìn)行加和。
MS1信息的準(zhǔn)確性堤器，取決于很多因素昆庇，比如色譜的噴霧足夠穩(wěn)定、樣品的純凈度高闸溃，嚴(yán)格控制污染等等整吆，這些條件都滿足了，才能得到比較完美的一級定量信息辉川，這對后續(xù)的定性定量分析都會有幫助表蝙。樣品的前處理和質(zhì)譜的維護(hù)這兩個關(guān)鍵的因素，一定要把握好乓旗，如果有影響府蛇，那么在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中，任何統(tǒng)計方法搜庫方法都無法挽回先前的污染信息屿愚。
樣品前處理相關(guān)閱讀>2. 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（4）
介紹完MS1譜圖中的主要信息以后汇跨，我們接下來說說MS2譜圖。
MS2簡單講就是將一條完整肽段送入質(zhì)譜進(jìn)行打碎之后得到的信息妆距。我們的碎裂過程一般來說是從肽段的N端和C端依次碎裂穷遂，我們很少會拿到兩端都碎裂的肽段，因此可以認(rèn)為這樣一個MS2譜圖中娱据，強(qiáng)度比較好的那些肽段絕大多數(shù)應(yīng)該都是來自于肽段的N端或者C端的一部分序列塞颁。
同時，這樣一些信號也會在類似于DIA/SWATH技術(shù)中用于定量吸耿，MS2譜圖中包含b-y離子以及其信號強(qiáng)度祠锣，可用于蛋白定性分析。而在一些比較新的技術(shù)如DIA/SWATH中咽安，b-y離子信息也可用于定量分析伴网。
Tips: TMT/iTRAQ技術(shù)并不用肽段碎片進(jìn)行定量，它是低分子量端額外加入一個同位素標(biāo)簽妆棒，用標(biāo)記的方法避免與b-y離子進(jìn)行互相干擾澡腾。沈老師提到沸伏，他個人更喜歡用TMT而不是iTRAQ進(jìn)行定量，因?yàn)閕TRAQ容易在100多到200左右分子量的區(qū)域產(chǎn)生大量的污染信號动分，這樣也會影響我們的定性分析毅糟。因此一般來說，iTRAQ能定量出來的蛋白澜公，在相同情況下都會比TMT少姆另。
什么是b-y離子
最后，我們來簡單介紹一下b-y離子坟乾。已經(jīng)了解的同學(xué)迹辐，可以跳過下面這一段。
下圖左上角是肽段碎裂的原理示意圖甚侣。我們用R來替代生物體內(nèi)的氨基酸的縮寫明吩，中間這一行是肽段的骨架。那么到底哪些鍵在質(zhì)譜碎裂時會斷開呢殷费？我們就會用相應(yīng)的位置對碎片來進(jìn)行定義印荔，所以可以看到a，b详羡，c仍律，x，y殷绍，z這六種離子形式染苛。當(dāng)然，更復(fù)雜的諸如糖之類的大分子主到，在碎裂后會產(chǎn)生更復(fù)雜的信號茶行。
b-y離子一般斷裂在羰基和氨基之間，a-x離子會有非常小比例的斷裂登钥，一般來說不太用于我們的定性分析畔师，c-z離子通常是出現(xiàn)在使用ETD（電子轉(zhuǎn)移解離）進(jìn)行碎裂的時候。
國際慣例牧牢，肽段從左到右排列的時候是從N端開始看锉，C端結(jié)束。任何一個氨基酸都有一個N端-NH2和C端-COOH塔鳍，在結(jié)合成多肽的時候伯铣，會脫掉一個水分子。所以我們平時在查看氨基酸的縮寫轮纫、名稱和分子量時腔寡，比如上圖的Gly，分子量為57.021464掌唾，比天然的氨基酸組成少了一個水分子放前。
在多肽中忿磅，絕大多數(shù)情況下這些氨基酸都是出現(xiàn)在中間的，因此我們是按照殘基的結(jié)構(gòu)形式來記錄他們的分子量凭语。當(dāng)斷裂成b-y離子的時候葱她，大家需要注意，得加上它的末端基團(tuán)似扔，再計算分子量吨些。比如b離子的分子量要加上一個-H，y離子要加上一個-OH虫几。
但是锤灿，細(xì)看看挽拔，會發(fā)現(xiàn)依然不對辆脸！因?yàn)檫€需要帶上電荷！
計算b-y離子時螃诅，N端除了加上之前失去的水分子里的-H以外啡氢，還要再加兩個-H，否則它就是帶負(fù)電荷的术裸。而在真實(shí)情況里倘是，質(zhì)譜記錄b-y離子時，y離子是要帶上至少一個正電荷的袭艺，我們一般記錄為MH+搀崭，即帶一個正電荷的形式。b-y離子當(dāng)然也可能帶兩個猾编、三個瘤睹，甚至更多的電荷，尤其是在母離子電荷數(shù)非常高的情況下答倡。
如果使用的是高分辨質(zhì)譜轰传，比如Orbitrap，它的MS2譜圖中都會有相應(yīng)的同位素分布瘪撇。因此我們可以計算出相應(yīng)的電荷數(shù)來進(jìn)行去卷積获茬，去完卷積之后，在搜庫時我們都傾向于將其記錄為MH+倔既，也就是帶一個正電荷的情況恕曲，以方便結(jié)果的查看。
大家可以看下圖的惡唑啉渤涌，N端第一個氨基酸是A（丙氨酸）佩谣，原始分子量是71。在記錄b離子時歼捏，就將其記錄為72稿存，因?yàn)橐右粋€-H笨篷。C端第一個氨基酸是k（賴氨酸），分子量是147.1，與平常我們看到的氨基酸列表中它的分子量是128哈肖，正好差一個-OH和兩個-H袍冷。因此手動計算b-y離子的時候，大家需要注意計算的方式冕臭。
事實(shí)上，離子帶的電荷數(shù)對蛋白鑒定會產(chǎn)生直接的影響燕锥，這個問題我們可以多聊幾句辜贵。
大伙兒知道，b-y離子一定是帶電荷的归形，才能被質(zhì)譜識別到信息托慨。假設(shè)在質(zhì)譜一級碎裂的時候，條件控制的不太好暇榴，就會出現(xiàn)母離子都只帶一個電荷厚棵，也就是同位素峰都只差一個道爾頓。
這種情況下去搜庫蔼紧，就會發(fā)現(xiàn)鑒定到的肽段會非常少婆硬，甚至鑒定不到任何東西！這是為什么呢奸例？
試想一下彬犯，如果母離子都只帶一個電荷，那么進(jìn)入二級碎裂查吊，因?yàn)槟阒挥幸浑姾尚城绻鸑端碎片帶了電荷，C端碎片便無法帶電荷菩貌。于是卢佣，雖然這些碎片離子也進(jìn)入了二級質(zhì)譜，但是由于它不帶電荷箭阶，我們的質(zhì)譜便無法記錄到它虚茶，造成后續(xù)譜圖的解析率就會非常的低。
為了解決這個問題仇参，現(xiàn)在大多數(shù)的肽段都是用Tripson酶解嘹叫，得到的片段在條件控制合適時基本都會帶2-3個電荷，這樣就非常適合進(jìn)行二級碎裂诈乒，使得碎裂片段的兩段都能帶電荷罩扇，于是質(zhì)譜就能記錄到這些碎片離子。
那么，母離子帶電荷太少了不行喂饥，是不是就越多越好呢消约？
事實(shí)上，高電荷的肽段也不太容易得到好的定性結(jié)果员帮！比如帶8個電荷的母離子碎裂后或粮，得到的b-y離子有可能帶1~7個電荷的各種可能，于是得到的二級譜圖會很復(fù)雜捞高。再加上肽段離子本身就很長氯材，比如有50-60氨基酸的長度，再把各種帶電荷的情況組合一下硝岗，得到的二級譜圖就很瘋狂了氢哮！在質(zhì)譜碎裂比較完美的前提下，一個肽段離子可能會對應(yīng)幾百張以上的二級譜圖的組合型檀！這對任何搜庫軟件來說都是極大的挑戰(zhàn)冗尤！
所以說，b-y離子帶23個電荷是最完美的贱除。大多數(shù)搜庫軟件都是針對23個電荷的譜峰而設(shè)計的生闲。這也是為什么ETD數(shù)據(jù)有時候解析不是那么理想媳溺，因?yàn)镋TD容易帶上更高的電荷月幌。
好，假設(shè)我們進(jìn)行得很順利悬蔽，得到了一堆成對的b-y離子扯躺，如下圖。我們根據(jù)這些b-y離子的質(zhì)荷比蝎困，就能解析出它們的氨基酸構(gòu)成录语，最終推算出蛋白質(zhì)的序列組成。
在用質(zhì)譜搜庫軟件進(jìn)行解析時禾乘，會對譜圖中的信息進(jìn)行識別和分析澎埠。二級譜圖的復(fù)雜性越高，對它解析的準(zhǔn)確性就會相應(yīng)的降低始藕。這也是為什么DIA和SWATH技術(shù)依舊依賴于DDA模式下鑒定結(jié)果來進(jìn)行匹配的原因之一蒲稳，純粹的基于SWATH和DIA的譜圖其解析難度是非常高的。
二級譜圖應(yīng)該是越干凈越好伍派，最最理想的情況是只包含上圖所示的14個b-y峰江耀，一旦出現(xiàn)別的峰，軟件便會嘗試去解析诉植，造成的影響就是可能會解析錯誤祥国，可能會讓解析的時間變長等等。當(dāng)然晾腔，一般都會出現(xiàn)雜峰和噪音舌稀，在這些干擾面前啊犬，就更要求我們對實(shí)驗(yàn)的各個步驟做好嚴(yán)格的質(zhì)控，以及選擇合適的搜庫策略和算法壁查。
Tips：
如果大伙兒對質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析原理感興趣椒惨，可以去Mascot官網(wǎng)去查看更多的信息：www.matrixscience.com/help.html.
