Nat Methods | 高通量繪制T細胞激活序列新方法，快速準確可擴展

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-09-14 10:11?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿生物大數(shù)據分析

撰文：huacishu

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1闪水、作者提出了一種稱為BATTLES（用于大規(guī)模外源性pMHC篩選的生物力學輔助T細胞觸發(fā)）的技術旬牲，該技術使用生物力學并行啟動肽和細胞的T細胞觸發(fā)废酷；

2淋昭、BATTLES可以用來探索基本的T細胞機制生物學和基于T細胞的免疫療法。

美國斯坦福大學Polly M. Fordyce教授課題組在國際知名期刊Nat Methods在線發(fā)表題為“A bead-based method for high-throughput mapping of the sequence- and force-dependence of T cell activation”的論文终佛。適應性免疫依賴于T淋巴細胞俊嗽，T淋巴細胞利用αβ T細胞受體（TCR）區(qū)分主要組織相容性復合物分子（pMHCs）呈現(xiàn)的多肽。識別能夠誘導強大T細胞應答的pMHCs不僅能夠更深入地理解控制免疫應答的機制铃彰，還可以在診斷和治療中有廣泛的應用绍豁。

本文中，作者提出了一種稱為BATTLES（用于大規(guī)模外源性pMHC篩選的生物力學輔助T細胞觸發(fā)）的技術牙捉，該技術使用生物力學并行啟動肽和細胞的T細胞觸發(fā)竹揍。BATTLES在由熱響應聚合物組成的光譜編碼磁珠上顯示候選pMHCs，該熱響應聚合物能夠向T細胞施加剪切載荷鹃共，有助于探索T細胞反應的力和序列依賴景觀鬼佣。BATTLES可以用來探索基本的T細胞機制生物學和基于T細胞的免疫療法。

適應性免疫反應依賴于T細胞敏感地區(qū)分非自我和自我的能力霜浴，使哺乳動物能夠檢測病原體感染或惡性轉化晶衷。在分子水平上，該過程由αβ T細胞受體（TCR）介導阴孟，該受體識別抗原呈遞細胞（APC）上表達的普遍存在的自身pMHCs中的主要組織相容性復合物分子（pMHCs）呈遞的稀有外源肽晌纫。抗原pMHC分子的TCR識別觸發(fā)下游信號事件（例如永丝，Ca2+通量）锹漱，最終調節(jié)T細胞活化，活化閾值由APC1上的抗原pMHC密度調節(jié)慕嚷。預測哪些肽序列將參與和激活特定TCR仍然具有挑戰(zhàn)性哥牍。

在這里，作者提出了一種BATTES技術喝检，該技術描述了數(shù)千個細胞在低密度和存在剪切載荷的情況下與不同pMHC相互作用的T細胞信號反應嗅辣。為了測試和驗證BATTES，作者對T細胞系（TCR589和TCR55）的反應進行了分析挠说，這些T細胞系先前顯示結合HIV-pol衍生肽（IPLTEEAEL澡谭，HIV-Pols）的反應具有不同的信號反應。超過11000個TCR589和TCR55細胞與21種肽相互作用的測量結果正確地重復了TCR58P的已知反應损俭，并確定了一種替代的合成肽序列（VPLTEDALL）蛙奖，該序列能夠在界面上以少至三種TCR–pMHC相互作用刺激TCR5細胞。

通過應用BATTES來系統(tǒng)地改變所呈現(xiàn)肽的施加力和密度的變化率杆兵，作者進一步確定雁仲，與這種替代合成肽相互作用的TCR55細胞在20–30pN?1時表現(xiàn)出最強的Ca2+反應負載，并且特性隨著pMHC密度的增加而降低琐脏。最后攒砖，對第三種經臨床測試的TCR（DMF5）的反應進行了分析。這些模型系統(tǒng)將BATTES確立為一種新技術，適用于更深入地了解TCR觸發(fā)的結構-活性關系祭衩，并在生理力條件下驗證新的pMHC抗原。

為了向細胞施加剪切力阅签，將T細胞沉積在含有pMHC的水凝膠珠的表面上掐暮，該水凝膠珠由熱響應性聚合物組成，使得它們在溫度發(fā)生微小變化時膨脹（圖1a）政钟。為了通過高通量單細胞顯微鏡監(jiān)測下游信號反應路克，用Ca2+敏感染料將T細胞和珠粒涂到微孔陣列中（圖1b）。通過將pMHCs與呈現(xiàn)的肽序列和嵌入的光譜代碼之間具有1:1關系的光譜編碼珠連接养交，每個實驗可以在<5小時內描繪大約1000–3000個細胞與>20個肽序列相互作用的反應精算。

熱響應水凝膠珠向細胞施加剪切載荷

刺激響應性聚合物已用于探測體組織內的機械生物學和單個細胞，包括T細胞碎连。收縮和膨脹的水凝膠微珠可在微珠-細胞界面向pMHC-TCR復合物施加均勻的膨脹力（圖1c）灰羽，施加到單個pMHC-TCMR復合物的載荷取決于形成的復合物的數(shù)量及其相對于細胞中心的位置。

溫度響應性聚合物（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAm）在臨界溫度下改變尺寸（圖1d）鱼辙，該臨界溫度可通過添加親水共聚單體（例如丙烯酸（AAc）或丙烯酸鈉（SAc））調節(jié)到生理范圍廉嚼，使用微流控液滴產生器生產含有55 mM SAc的單分散NIPAm液滴，然后通過分批UV曝光將這些液滴聚合成固體珠倒戏，在室溫下產生約23.75 μm半徑的珠粒怠噪。

為了量化冷卻時半徑的變化，隨后將12個珠子加載到錫氧化物（ITO）載玻片上杜跷，并在將溫度升高至37°C的同時成像傍念，然后讓溫度在120 s內冷卻至34°C（圖1e）。珠子在加熱后收縮1.49±0.16 μm葛闷，然后在冷卻后膨脹0.81±0.06 μm（圖1f憋槐，g）；60秒后孵运，熱響應達到平衡秦陋，珠半徑保持不變。雖然37至34°C的溫度可以改變Ca2+信號的時間治笨，但總累積信號保持不變驳概，這表明Ca2+的信號僅反映對力的響應。

光譜編碼珠可以并行測試許多肽

理解肽序列如何支配T細胞信號需要在評估下游反應的同時系統(tǒng)地改變所呈現(xiàn)的序列的能力旷赖。光譜編碼的微珠允許在單個實驗中對多個TCR–pMHC相互作用施加力顺又，作者之前生產的聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEG-DA）水凝膠微珠包含超過1000個不同的光譜條形碼（圖2a）。為了測試PNIPAm是否與光譜編碼兼容等孵，作者制備了含有常量銪（Eu）稚照、鏑（Dy）和釤（Sm）的21種組合的羧化PNIPAm珠（圖2b）。21個不同的珠Sm/Eu和Dy/Eu比率簇與預期目標比率一致（圖2c）。

編碼的珠子可以顯示生理低密度的肽

接下來果录，將HLA-B35負載肽文庫與這些珠子偶聯(lián)上枕，該文庫包含HIV pol衍生肽（Pol448–456，IPLTEAEL）中的系統(tǒng)突變弱恒。這些pMHCs先前已顯示在酵母中結合兩個TCR（TCR55和TCR589）辨萍，并驅動激活（圖2d，e）返弹。通過紫外線（UV）將感興趣的肽加載到生物素化pMHC復合物的B35 MHC凹槽中锈玉，然后與鏈霉親和素包被的珠溫育生物素化pMHC復合物（圖2f）。所有UV交換和偶聯(lián)反應都在單獨的體積中進行义起，以將肽序列與嵌入的光譜代碼唯一地連接拉背。

為了確保施加到單個pMHC–TCR復合物上的剪切力不會因許多附著點的存在而顯著減弱，需要將pMHC復合物以低密度與珠耦合默终。為了量化界面pMHC密度椅棺，用熒光標記的抗β2單克隆抗體孵育珠粒，并通過全內反射熒光顯微鏡對珠粒-玻璃界面處的珠粒表面進行成像（圖2g）穷蛹。順應性水凝膠珠沉積在蓋玻片表面上土陪，產生直徑約50 μm的可觀察斑點（圖2h），單個抗體標記的界面pMHC顯示為分散的熒光點肴熏。

配對細胞和珠子探針的力和序列依賴性激活

為了在對pMHC–TCR相互作用施加剪切力時對單個T細胞進行高通量成像鬼雀，作者制造了一個包含1440個微孔的裝置，該裝置允許在每個孔內順序加載單個珠粒蛙吏，然后在頂部加載一個或多個T細胞（圖3a源哩，b）。

在最初的1小時孵育后鸦做，讓細胞在沒有流動的情況下與珠結合的pMHCs相互作用并附著励烦，輕輕沖洗掉未附著的細胞，然后將裝置1分鐘溫度升高至37°C泼诱，然后2分鐘冷卻至34°C坛掠；隨后通過Cal-520熒光對珠子相關細胞的Ca2+通量進行成像，通過對與每個細胞相關的像素的熒光強度求和治筒，可以直接監(jiān)測單個T細胞信號屉栓。

BATTLES可以識別已知的刺激性激動劑

如果BATTLES能夠可靠地識別刺激肽，作者期望看到HIV-pol誘導的TCR589的Ca2+通量耸袜。為了測試這一點友多，對961個TCR58p轉導的T細胞與所有21個珠結合的pMHCs相互作用的Ca2+通量進行了定量（圖2c）。圖像顯示所有微孔內的珠的負載（圖3b）堤框；在裝置加熱和冷卻期間獲得的視頻證實域滥，冷卻如預期增加了珠半徑纵柿，并且T細胞始終保持與珠表面接觸（圖3b）。冷卻后启绰，所有肽的力誘導Ca2+通量的熒光圖像顯示了多種行為（圖3c-e）昂儒。?

對于TCR589細胞，HIV pol肽（IPLTEEAL）產生了高百分比的“陽性”T細胞反應委可，“陽性”細胞具有最大的整合強度信號（圖3e-g）荆忍。Ca2+信號傳導的總體動力學和振幅在不同天進行的實驗復制之間不同，這可能是由于隨著時間的推移整個群體中細胞狀態(tài)的變化撤缴，然而，IPLTEAEL肽始終觸發(fā)最大比例的細胞并在每個復制實驗中產生最高整合Ca2+信號（圖3h）叽唱，確定了BATTLES可以識別能夠在體內產生強大細胞毒性反應的肽表位屈呕。

BATTLES可以識別新的肽激動劑

接下來，作者測試了BATTLES是否能夠識別TCR55轉導的T細胞的替代有效激動劑棺亭，這些T細胞在沒有激活的情況下結合HIV pol（圖4a）虎眨。與TCR589相反，HIV pol肽IPLTEEAL沒有誘導顯著的Ca2+反應镶摘；相反嗽桩，突變肽（VPLTEDALL）在兩個生物復制中產生最強的功能反應（圖4b-d）。

Ca2+信號隨施加力的速率而變化

在PNIPAm珠疗喔遥基質中加入不同量的SAc改變了相對親水性/疏水性比率和溫度誘導溶脹時半徑的變化率（圖5a）碌冶，從而調整最大施加力的變化率。作者聚合了分別含有50涝缝、55或60 mM SAc的熱響應珠（圖5a）扑庞。聚合后，所有三種配方的珠粒半徑均保持不變拒逮，但從37℃到34℃冷卻時的半徑變化很大（圖5c）罐氨。

先前使用細胞共培養(yǎng)分析的工作表明，VPLTEDAEL滩援、VPITEDSQL和HIV pol（IPLTEEAEEL）肽驅動TCR55的高栅隐、中和不存在的信號反應。這些結果還表明玩徊，VPLTEDALL對TCR55轉導的T細胞觸發(fā)最強的Ca2+信號反應租悄，這與先前的肽脈沖APC共培養(yǎng)結果不一致，該結果將VPLTEDAEL確定為最有效的激動劑（圖5d）佣赖。

多重濃度顯示劑量依賴性反應

為了測試信號反應是否取決于呈現(xiàn)的密度恰矩，使用相同的四種TCR55結合肽序列（VPLTEDALL、VPITEDSQL憎蛤、VPLTEDAEL和IPLTEAEL）在三種有效濃度下進行了BATTLES測定外傅。

在1倍濃度下纪吮，VPLTEDALL再次驅動最強的下游響應（圖5f-h）。對于七倍高的pMHC密度萎胰，VPLTEDALL的整合Ca2+信號保持恒定碾盟，但與其他三種肽相關的信號增加，表明特異性喪失（圖5f-h）技竟。在27倍高的pMHC密度下冰肴，與VPLTEDAEL相關的整合Ca2+信號進一步增加，以驅動最強的響應（圖5f–h）榔组。這些結果強調了需要在低pMHC密度下進行篩選熙尉，以模擬生理機械轉導，并在體內識別可能有效的激動劑搓扯。

BATTLES可以揭示臨床測試的TCR的交叉反應性

最后检痰，將BATTLES應用于臨床測試TCR的反應。DMF5識別由I類MHC蛋白呈遞的MART-1黑色素瘤抗原锨推，DMF5轉導的T細胞與MART-126-35肽負載的樹突狀細胞相互作用的臨床試驗證明了腫瘤消退铅歼。先前的酵母展示實驗揭示了結合DMF5 TCR的兩類不同的肽：（1）含有疏水核心序列的MART-1樣肽（P4-6中的GIG）和（2）含有高電荷中心核心的肽（P44-6中DRG）（圖6a）；然而换可，目前尚不清楚這兩類肽在低密度時是否會驅動類似水平的T細胞活化椎椰。

為了評估生理密度下的反應性，對與11種肽相互作用的DMF5 T細胞進行了研究：5種GIG類肽沾鳄、5種DRG類肽和一種陰性對照肽慨飘。與已知作用一致，MART-1錨定修飾的十聚體（ELAGIGILTV）在兩個重復中驅動最強的Ca2+反應（圖6b-d）译荞。因此套媚，BATTLES可以揭示候選治療性TCR對不同表位的潛在交叉反應性，即使對于沒有顯著相似性的基序磁椒，也可以提供預測非靶向效應的臨床相關信息堤瘤。

討論

T細胞在免疫監(jiān)督和免疫突觸形成過程中對APC施加剪切力。TCR-pMHC上的這種物理負載可以通過促進非我和自我之間的區(qū)分來提高識別的敏感性和特異性浆熔。因此本辐，在體外重述穩(wěn)健的T細胞活化需要以下能力：（1）顯示能夠在低密度下驅動TCR觸發(fā)的肽，（2）施加剪切力以驅動機械轉導医增，以及（3）監(jiān)測下游T細胞信號慎皱。BATTLES平臺概括了這些物理化學線索，并可以在<5小時內篩選與數(shù)千個細胞相互作用的肽序列叶骨。

基于親和力的篩選方法測定了103-109個不同的序列茫多，促進了對潛在序列空間的深入探索。雖然先前的數(shù)據表明忽刽，在沒有負載的情況下測量的平衡結合親和力不能準確預測所呈現(xiàn)肽的活化潛力天揖，但已知激動劑肽通常以至少中等親和力結合TCR夺欲。因此，識別新激動劑的有效管道可以從高通量結合篩選開始今膊，然后使用BATTLES有效測試數(shù)百到數(shù)千個候選“點擊”些阅，以確定其在低密度和負載下顯示時激活T細胞的潛力。

在未來的工作中斑唬，BATTLES可以應用于廣泛的其他問題市埋。雖然作者在這里僅測定了21個肽，但基于光譜編碼之前已經產生了超過1100個編碼恕刘，這表明將來可以應用于更大的文庫缤谎。擴展的肽文庫可用于系統(tǒng)地描述TCR或呈現(xiàn)的肽序列的變化如何改變負載下的活化和肽免疫原性。

此外褐着，未來與scRNAseq和scTCRseq相結合可能進一步擴大序列的數(shù)量弓千。在醫(yī)學上，將Ca2+成像與檢測活化相關的表面標記物相結合献起，可以在自體移植前篩選親和力成熟的TCR或嵌合抗原受體（CAR）T細胞的交叉反應性，從而減少毒性的風險镣陕。最后谴餐，BATTLES可以作為其他免疫細胞、粘附細胞甚至神經元的通用機械生物學工具呆抑。

教授介紹

Polly Fordyce是斯坦福大學遺傳學和生物工程助理教授岂嗓，她的實驗室致力于開發(fā)和應用新的微流體平臺，用于定量鹊碍、高通量生物物理和生物化學以及單細胞基因組學厌殉。她畢業(yè)于University of Colorado at Boulder，獲得了物理學和生物學本科學位侈咕，之后前往Stanford University公罕，獲得了物理學博士學位。在她的博士后研究中耀销，她與Joe DeRisi教授合作開發(fā)了一種新的微流體平臺楼眷，用于了解轉錄因子如何識別和結合其DNA目標。

在她的實驗室中熊尉，使用微流體和廣泛的硬件自動化罐柳，通過3個主要平臺以前所未有的規(guī)模執(zhí)行研究：1.基于陣列的多路復用實驗（MITOMI和HT-MEK）。了解轉錄因子如何發(fā)現(xiàn)并結合其基因組靶點來調節(jié)基因表達狰住，以及了解酶如何實現(xiàn)其非凡的催化效率和底物特異性张吉。2.MRBLEs，依賴于光譜來跟蹤整個實驗中的分析物催植“褂迹可以創(chuàng)建包含超過1000種不同比例的微球勺择，這些微球可以單獨通過成像進行唯一識別。3.Dropception是一個微流體平臺蔗崎，用于創(chuàng)建雙乳液（油包水）液滴酵幕，可以使用標準流式細胞儀進行高通量分選。

參考文獻

Feng Y, Zhao X, White AK, Garcia KC, Fordyce PM. A bead-based method for high-throughput mapping of the sequence- and force-dependence of T cell activation. Nat Methods. 2022;10.1038/s41592-022-01592-2. doi:10.1038/s41592-022-01592-2