翻譯組簡介
翻譯組研究可幫助科研人員發(fā)現(xiàn)及鑒定新蛋白，從翻譯水平探究基因表達(dá)對(duì)疾病影響的機(jī)制以及解釋轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平結(jié)果不一致等問題丈秩。近年來盯捌，翻譯組的應(yīng)用越來越廣泛淳衙，研究人員結(jié)合翻譯組與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)蘑秽，在探究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制、發(fā)育調(diào)控箫攀、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)出了不少科研成果肠牲。翻譯組學(xué)的研究方法包括RNC-seq（全長翻譯組測序）、Ribo-seq（核糖體足跡測序）和Polysome profiling（多聚核糖體圖譜）等靴跛。這里缀雳，我們主要介紹一下Ribo-seq——核糖體足跡測序。
Ribo-seq簡介
核糖體保護(hù)的mRNA 片段可以免受RNA酶的降解作用梢睛。使用低濃度RNase處理核糖體-新生肽鏈復(fù)合物肥印，降解掉沒有核糖體覆蓋的mRNA片段识椰，可獲得被核糖體保護(hù)的約22~30bp的RNA小片段，即核糖體足跡（ribosome footprints深碱，RFP）腹鹉。Ribo-seq通過對(duì)RFP進(jìn)行測序，其可幫助我們得到核糖體分布的位置信息敷硅，并可幫助研究人員推測起始密碼子位置以及uORFs等信息功咒。
Ribo-seq研究思路
1.?表達(dá)量分析
我們時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)豐度和RNA表達(dá)量的相關(guān)性并不理想，這時(shí)候绞蹦，我們可以通過研究基因的翻譯表達(dá)量從而解釋這一現(xiàn)象力奋。除此之外，當(dāng)在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)過多或過少的差異基因幽七，我們可以通過將翻譯組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析景殷，優(yōu)化目標(biāo)基因的篩選范圍；也可以通過與轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行共表達(dá)分析澡屡，找到符合預(yù)期表達(dá)模式的基因滨彻，再進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證。
文獻(xiàn)案例
PM2.5 promotes NSCLC carcinogenesis through translationally and transcriptionally activating DLAT-mediated glycolysis reprograming
PM2.5通過翻譯和轉(zhuǎn)錄激活DLAT介導(dǎo)的糖酵解重編程來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）癌變
發(fā)表時(shí)間：2022年7月
發(fā)表期刊：J Exp Clin Cancer Res
影響因子：12.66
研究背景：PM2.5誘發(fā)癌癥的分子機(jī)制仍不清楚挪蹭。
研究目的：利用多組學(xué)技術(shù)和多種分子實(shí)驗(yàn)探討PM2.5調(diào)節(jié)NSCLC癌變的機(jī)制亭饵。
研究結(jié)論：PM2.5增強(qiáng)eIF4E（真核生物翻譯起始因子）的表達(dá)，從而增加糖酵解基因DLAT在多聚核糖體中的翻譯梁厉，抑制NSCLC細(xì)胞凋亡辜羊。
樣本類型：BEAS-2B細(xì)胞、A549細(xì)胞
技術(shù)類型：Ribo-seq词顾、Polysome profiling八秃、RNA-seq
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
該研究分析了正常人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）暴露于PM2.5后細(xì)胞翻譯組及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的改變，發(fā)現(xiàn)PM2.5可誘導(dǎo)糖酵解代謝通路基因翻譯效率上調(diào)肉盹，其中DLAT的TE升高最為顯著昔驱。功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DLAT促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，敲低DLAT則產(chǎn)生相反的效果上忍。機(jī)制研究表明PM2.5分別通過兩種不同的途徑調(diào)控DLAT基因的表達(dá)骤肛。首先，PM2.5增強(qiáng)細(xì)胞真核翻譯起始因子eIF4E的表達(dá)窍蓝，從而增加DLAT在多聚核糖體中的翻譯腋颠； 其次，PM2.5激活轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)吓笙，促進(jìn)DLAT的轉(zhuǎn)錄淑玫。這些結(jié)果提示DLAT可作為NSCLC的一種診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
2.?調(diào)控分析
在表達(dá)量分析的基礎(chǔ)上絮蒿，可進(jìn)一步研究導(dǎo)致翻譯表達(dá)量發(fā)生顯著變化的調(diào)控機(jī)制尊搬。據(jù)報(bào)道，常見影響翻譯速率的因素有uORF（Upstream open reading frames）土涝、miRNA和表觀修飾毁嗦。uORF是位于CDS上游5'UTR區(qū)域的開放閱讀框，其普遍存在于真核生物的mRNAs中回铛。翻譯起始是mRNA翻譯的限速步驟狗准，uORF可通過調(diào)控翻譯起始影響下游CDS的翻譯。miRNA是一類小非編碼RNA茵肃，其可通過mRNA轉(zhuǎn)錄后的抑制協(xié)調(diào)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)腔长。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA會(huì)通過結(jié)合3’UTR序列并誘導(dǎo)脫腺苷酸化、去帽化和5’-3’降解验残，降低靶mRNA的翻譯能力和穩(wěn)定性捞附。表觀修飾，如m6A是真核mRNA最普遍的內(nèi)部修飾您没，參與多種生理過程鸟召，可參與調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)氨鹏、定位欧募、翻譯和RNA-蛋白相互作用來調(diào)控RNA的命運(yùn)。已有大量研究發(fā)現(xiàn)m6A存在動(dòng)態(tài)變化仆抵，會(huì)影響到mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率跟继，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
文獻(xiàn)案例
文獻(xiàn)一
Targeting N6-methyladenosine reader YTHDF1 with siRNA boosts antitumor immunity in NASH-HCC by inhibiting EZH2-IL-6 axis
通過使用siRNA靶向N6-甲基腺苷閱讀蛋白YTHDF1抑制EZH2-IL-6軸镣丑，增強(qiáng)NASH-HCC的抗腫瘤免疫
發(fā)表時(shí)間：2023年11月
發(fā)表期刊：Journal of Hepatology
影響因子：26.11
研究背景：NASH相關(guān)的肝癌（NASH-HCC）占肝癌患者的比例也越來越高舔糖。然而 NASH-HCC 的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，臨床還未有治療NASH-HCC的藥物或者其他生物療法莺匠。
研究目的：探究NASH-HCC對(duì)ICB治療耐藥究的原因金吗，尋找合適的治療靶點(diǎn)。
研究結(jié)論：YTHDF1-EZH2-IL-6 信號(hào)軸可以募集和激活 MDSCs 趣竣，以致細(xì)胞毒性 CD8+?T細(xì)胞發(fā)生功能障礙摇庙，從而促進(jìn) NASH-HCC 的發(fā)生和發(fā)展。靶向YTHDF1可以提高NASH-HCC 抗anti-PD1免疫治療應(yīng)答新靶點(diǎn)期贫。
樣本類型：肝癌組織免疫細(xì)胞
技術(shù)類型：m6A-seq跟匆、RIP-seq异袄、Ribo-seq通砍、Western Blot
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
該研究發(fā)現(xiàn)NASH-HCC患者腫瘤組織中YTHDF1的表達(dá)水平相較于鄰近正常組織顯著升高。作者利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)Ythdf1可以促進(jìn)NASH-HCC的發(fā)生和發(fā)展。RNA-seq結(jié)果提示免疫系統(tǒng)受到Y(jié)thdf1的影響封孙，sc-RNA seq和流式分析結(jié)果顯示Ythdf1誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）的積累并抑制細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的功能迹冤。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ythdf1可誘導(dǎo)IL-6的分泌增加并且介導(dǎo)MDSCs的募集和激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性CD8+?T細(xì)胞發(fā)生功能障礙虎忌。作者聯(lián)合m6A-seq泡徙、RIP-seq，Ribo-seq和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)研究膜蠢，發(fā)現(xiàn)EZH2 mRNA是YTHDF1的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)堪藐。YTHDF1 識(shí)別EZH2 mRNA上m6A修飾位點(diǎn)促進(jìn)EZH2的翻譯，EZH2進(jìn)一步促進(jìn)IL-6的表達(dá)和分泌挑围。
文獻(xiàn)二
Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection
普遍存在的下游RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)地決定起始密碼子的選擇
發(fā)表時(shí)間：2023年9月
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：64.8
研究背景：真核生物基因的翻譯受到mRNA中的結(jié)構(gòu)特征調(diào)控礁竞，其中包括5'端前導(dǎo)序列中廣泛存在的上游起始密碼子(uAUGs) 。這些uAUGs可替代主要的AUG（mAUG）與翻譯起始復(fù)合物結(jié)合杉辙，改變蛋白質(zhì)合成的起始點(diǎn)模捂，從而抑制下游mAUG的翻譯。
研究目的：探究uAUG被識(shí)別從而調(diào)控下游蛋白翻譯的機(jī)制蜘矢。
研究結(jié)論：uAUG-ds介導(dǎo)起始復(fù)合物與uAUGs結(jié)合從而抑制下游mORF的翻譯狂男，抑制免疫蛋白的表達(dá)；
樣本類型：擬南芥幼苗
技術(shù)類型：Ribo-seq品腹、RNA-seq
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
作者對(duì)正常及elf18處理的擬南芥幼苗進(jìn)行RNA-seq及Ribo-seq岖食，分析得到13051個(gè)mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表達(dá)轉(zhuǎn)錄物（含有uAUGs），并根據(jù)其翻譯效率的變化分為TE-up舞吭、TE-nc和TE-down三組县耽。為了鑒定uAUGs在翻譯調(diào)控中的作用，作者又從這13051個(gè)轉(zhuǎn)錄物中篩選出翻譯型uAUGs镣典，發(fā)現(xiàn)翻譯型uAUGs在TE-up組中顯著富集兔毙，表明了uAUGs在調(diào)節(jié)免疫相關(guān)翻譯中具有普遍作用。此外兄春，作者還發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組翻譯型uAUGs的翻譯起始率較高澎剥，而elf18處理后這種類型的uAUGs翻譯起始率顯著降低。由于uAUGs起始的翻譯通常會(huì)抑制下游mORFs翻譯赶舆，所以在elf18處理下uAUGs起始的翻譯的減少也解除了對(duì)下游mORFs翻譯的抑制作用哑姚。為了確定uAUGs影響翻譯起始的機(jī)制，作者評(píng)估了轉(zhuǎn)錄本中的Kozak序列及RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)芜茵，證實(shí)了雙鏈RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)（mAUG-ds和uAUG-ds）影響翻譯起始調(diào)控的可能性叙量。之后，作者通過分析Ribo-seq數(shù)據(jù)九串，發(fā)現(xiàn)了TE-up轉(zhuǎn)錄物中elf18處理可以啟動(dòng)uORFs翻譯起始到mORFs翻譯起始的轉(zhuǎn)變绞佩∷屡福總的來說，該研究發(fā)現(xiàn)了調(diào)控uAUG與起始復(fù)合物結(jié)合的翻譯調(diào)控元件uAUG-ds品山，在正常生長條件下胆建，uAUG-ds介導(dǎo)起始復(fù)合物與uAUGs結(jié)合從而抑制下游mORF的翻譯，抑制免疫蛋白的表達(dá)肘交；當(dāng)植物處于免疫應(yīng)答中笆载，uAUG-ds被RNA解旋酶解螺旋，uAUGs不再與起始復(fù)合物結(jié)合涯呻，進(jìn)而促進(jìn)下游mORF的翻譯凉驻，促進(jìn)免疫蛋白的表達(dá)。
3.?編碼能力分析
非編碼RNA的編碼能力研究一直是近年來的研究熱點(diǎn)复罐。而Ribo-seq技術(shù)由于可以檢測正在翻譯的RNA而常被用來進(jìn)行sORF（小開放閱讀框）可編碼能力的預(yù)測沿侈。Ribo-seq是預(yù)測sORF編碼能力的強(qiáng)大工具。首先市栗，我們可以通過三堿基周期分析缀拭，判斷該ORF是否具有翻譯能力。核糖體的P位點(diǎn)是翻譯過程中的肽鏈延伸位點(diǎn)填帽，核糖體在該位點(diǎn)的停留時(shí)間最長蛛淋，因此正在翻譯的RNA的三堿基周期圖呈現(xiàn)“高低低”的分布，而普通RNA則無此規(guī)律篡腌。其次褐荷，我們可基于檢測分析工具如Ribo Taper、ORF Rater嘹悼、ORF finder以及ORF score等指標(biāo)來評(píng)估ORF的編碼潛力叛甫。
文獻(xiàn)案例
文獻(xiàn)一
Developmental Dynamics of RNA Translation in the Human Brain
人大腦發(fā)育過程中RNA翻譯的動(dòng)態(tài)變化
發(fā)表時(shí)間：2022年10月
發(fā)表期刊：Nature Neuroscience
影響因子：25.0
研究背景：基因表達(dá)的精確調(diào)控是神經(jīng)發(fā)育、可塑性和認(rèn)知功能的基礎(chǔ)杨伙。雖然已有研究描繪了發(fā)育中的人腦中的轉(zhuǎn)錄其监，但對(duì)這一過程中翻譯調(diào)控的研究仍有空缺。
研究目的：深入探討了人類大腦發(fā)育過程中RNA翻譯的動(dòng)態(tài)變化限匣。
研究結(jié)論：繪制了人類大腦的翻譯圖譜抖苦，揭示了基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并識(shí)別了數(shù)千個(gè)之前未知的翻譯事件米死，包括產(chǎn)生人類大腦特異性微肽的小開放閱讀框（sORFs）锌历。
樣本類型：人大腦皮質(zhì)樣本、人腦組織峦筒、培養(yǎng)的hESC衍生神經(jīng)元細(xì)胞
技術(shù)類型：Ribo-seq究西、RNA-seq、質(zhì)譜
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
作者通過分析大腦皮質(zhì)樣本及大腦樣本Ribo-seq數(shù)據(jù)中的三堿基周期物喷，確認(rèn)了活躍翻譯的核糖體位置卤材。共識(shí)別到172187個(gè)活躍翻譯ORFs遮斥，映射到13305個(gè)基因。作者把接下來的研究集中于鑒定和分析sORFs上商膊，其識(shí)別了來自8278個(gè)基因的38187個(gè)活躍sORFs伏伐，其中多個(gè)sORF來源于之前被注釋為非編碼的轉(zhuǎn)錄本宠进。之后晕拆，作者將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Ribo-seq結(jié)果進(jìn)行匹配，在蛋白質(zhì)水平上獨(dú)立證實(shí)了這些sORFs的翻譯材蹬。此外实幕，作者還探討了uORFs在調(diào)控典型ORFs翻譯中的作用，發(fā)現(xiàn)某些uORFs與下游典型ORFs的翻譯呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)堤器。通過對(duì)sORF進(jìn)行序列分析昆庇，作者預(yù)測了微肽的理化特性，并探討了它們的潛在生物學(xué)功能闸溃，發(fā)現(xiàn)這些sORF編碼的微肽可能與RNA加工復(fù)合物相互作用整吆，進(jìn)而控制細(xì)胞核中mRNA剪接、翻譯或DNA損傷反應(yīng)辉川。該研究揭示了人類大腦翻譯組的復(fù)雜性表蝙，并指出了非典型ORFs在大腦發(fā)育和疾病中的潛在作用。為未來研究翻譯調(diào)控在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用以及闡明許多新的人類大腦特異性微肽的功能提供了寶貴的資源和新的研究方向乓旗。
文獻(xiàn)二
The cardiac translational landscape reveals that micropeptides are new players involved in cardiomyocyte hypertrophy
心臟翻譯圖譜揭示短肽或?qū)е滦募〖?xì)胞肥大
發(fā)表時(shí)間：2021年7月
發(fā)表期刊：?Molecular Therapy
影響因子：12.4
研究背景：心肌細(xì)胞肥大是心臟在生理或病理刺激后進(jìn)行重構(gòu)的主要代償反應(yīng)之一府蛇，其特征為由mRNA翻譯介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)。然而屿愚，這種誘導(dǎo)在翻譯水平上的機(jī)制還未確定汇跨。目前尚不清楚蛋白質(zhì)合成效率的提高是由于核糖體數(shù)量增加還是翻譯速率增加。
研究目的：分析肥大心肌細(xì)胞中能被翻譯的RNA分子妆距、RNA翻譯的規(guī)律及機(jī)制穷遂；
研究結(jié)論：將翻譯組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了由lncRNA編碼的多個(gè)影響心肌細(xì)胞肥大的功能性短肽娱据。
樣本類型：新生大鼠心肌細(xì)胞
技術(shù)類型：Ribo-seq塞颁、RNA-seq、Western Blot
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
為了研究心肌細(xì)胞肥大過程中如何在全基因組范圍內(nèi)調(diào)節(jié)翻譯吸耿，作者分離了新生大鼠心肌細(xì)胞并用PE刺激24小時(shí)祠锣，然后，收獲細(xì)胞并進(jìn)行Ribo-seq和RNA-seq以檢測心肌細(xì)胞肥大過程中蛋白質(zhì)編碼基因的核糖體占有率和轉(zhuǎn)錄組變化咽安。發(fā)現(xiàn)伴网，81.4% 的reads能比對(duì)到帶注釋的蛋白質(zhì)編碼基因的ORF，6.5%的reads比對(duì)到uORF妆棒，3.9%的reads比對(duì)到長鏈非編碼RNA（lncRNA）澡腾，表明這些lncRNA具有編碼潛力沸伏。RNA-seq和Ribo-seq分析進(jìn)一步證實(shí)了心肌肥大marker mRNA在心肌細(xì)胞肥大過程中表達(dá)和翻譯增強(qiáng)，而且在PE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中动分，大多數(shù)mRNA翻譯過程中的核糖體利用率沒有顯著變化毅糟。Ribo-seq數(shù)據(jù)的KEGG分析結(jié)果顯示，核糖體是富集程度最高的澜公，提示核糖體蛋白的合成在肥大心肌細(xì)胞中增強(qiáng)姆另。進(jìn)一步分析驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)是核糖體數(shù)量增加而非翻譯速率上升導(dǎo)致的。之后坟乾，作者還在全基因組范圍內(nèi)鑒定新的sORF迹辐，作者將Ribo-seq reads與非編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了103個(gè)sORFs與已注釋的lncRNA相匹配甚侣，作者隨機(jī)選擇了15個(gè)sORFs進(jìn)行分析和表達(dá)驗(yàn)證明吩，證實(shí)lncRNAs可以編碼短肽。最后殷费，作者通過過表達(dá)及RNA-seq測序分析印荔，發(fā)現(xiàn)sORF8通過調(diào)節(jié)線粒體功能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥厚生長，而sORF6和sORF7短肽通過ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌肥大详羡。
總結(jié)
以上為Ribo-seq的常見研究思路匯總及文獻(xiàn)案例仍律。總的來說殷绍，翻譯組研究可分為表達(dá)量分析染苛、翻譯調(diào)控分析、發(fā)現(xiàn)新的可翻譯分子三個(gè)方向主到。表達(dá)量分析可以揭示關(guān)于細(xì)胞中活躍翻譯的RNA片段定量信息茶行，從而幫助研究者了解不同條件下的基因表達(dá)水平；翻譯調(diào)控分析可幫助識(shí)別翻譯速率變化登钥，揭示翻譯調(diào)控分子機(jī)制畔师，包括起始密碼子選擇、翻譯效率以及可能的翻譯后調(diào)控牧牢；編碼能力分析有助于發(fā)現(xiàn)新的mRNA剪接變體看锉、非編碼RNA或非傳統(tǒng)的開放閱讀框，揭示它們在特定生物學(xué)過程中起重要作用塔鳍。
