系列筆記基于達(dá)澈生物講座視頻昏滴，從中初步學(xué)習(xí)了解生信分析中常遇到的組學(xué)分析技術(shù)鄙信。
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1、核糖體ribosome
參考https://www.nature.com/scitable/topicpage/ribosomes-transcription-and-translation-14120660/
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簡單來說薇芝，核糖體是mRNA翻譯蛋白質(zhì)的場所；
中心法則
其中翻譯遵循的規(guī)律是mRNA單鏈上每三個(gè)核苷酸稱之為一個(gè)密碼子丰嘉，對應(yīng)一種氨基酸夯到。
image from wiki -
大致翻譯步驟（參考下圖）
(1) 當(dāng)核糖體接觸、識別到mRNA的啟動子（AUG）饮亏，翻譯開始耍贾；
(2) tRNA將對應(yīng)氨基酸運(yùn)到密碼子附近；
(3, 4, and 5) 氨基酸結(jié)合路幸，tRNA位移荐开，往復(fù)循環(huán)；
(6) 當(dāng)遇到終止密碼子時(shí)简肴，翻譯結(jié)束晃听。核糖體脫落，并形成一條肽鏈砰识。
image form https://www.nature.com/ -
關(guān)于核糖體主要由rRNA與蛋白質(zhì)組成能扒，通常認(rèn)為是由兩個(gè)亞基結(jié)構(gòu)。翻譯時(shí)把mRNA“夾在中間”
ribosome 'sandwich' when translation
特殊的幾種翻譯情況
- 非編碼RNA（lncRNA）
（1）70%DNA可轉(zhuǎn)錄RNA辫狼；3%DNA轉(zhuǎn)錄可編碼的mRNA初斑；
（2）不翻譯的原因有很多例如無法出細(xì)胞核、無法接觸翻譯機(jī)器....- 部分翻譯
一般指從非AUG啟動子區(qū)域開始翻譯- 過度翻譯
一般指circRNA的情況予借，蛋白氨基酸數(shù)量遠(yuǎn)大于對應(yīng)原始編碼鏈長度
2越平、ribo-seq
- 指ribosome-seq，于2009年在science發(fā)表灵迫，是翻譯組學(xué)的一種方法秦叛；
- 對在某一時(shí)刻下，捕捉到所有核糖體正在翻譯的瀑粥，所結(jié)合的mRNA序列（片段）挣跋；
2.1 實(shí)驗(yàn)步驟
主要參考2009年在science文獻(xiàn)，之后的方法也大同小異
- （1） robustly generate ribosome-protected mRNA fragments (“footprints”) whose sequences indicate the position of active ribosomes;
這一步是ribo-seq的關(guān)鍵狞换，通過添加翻譯抑制劑避咆，使核糖體停止翻譯，并在該狀態(tài)下“綁”在mRNA上修噪；然后對mRNA降解消化查库，核糖體mRNA符合物受到保護(hù)而“富集”。
如下圖黄琼，ribo-seq的關(guān)鍵就是產(chǎn)生ribosome-protected mRNA fragments(RPFs)樊销。圖右是常規(guī)RNA-seq測序的input對照
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（2）convert these RNA footprints into a library of DNA molecules in a form that is suitable for deep sequencing with minimal distortion;
簡單來說就是將RPFs制備DNA測序文庫；
second step - （3）measure the abundance of different footprints in this library by means of deep sequencing.
最后進(jìn)行二代測序
2.2 數(shù)據(jù)特征
- 由于ribo-seq相當(dāng)于是核糖體捕捉的mRNA片段測序，所以測序比對結(jié)果上有許多不同于傳統(tǒng)RNA-seq之處
（1）read length distribution
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大部分的RPFs長度集中在28~30nt長度
如下圖上下為核糖體的60S围苫、40S亞基裤园，中間代表處于核糖體內(nèi)被保護(hù)的mRNA序列。
image.png -
在線粒體與葉綠體中翻譯的RPFs長度分布略有不同剂府。
image.png
（2）read located annotation
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大部分RPFs還是位于CDS區(qū)拧揽；
image.png -
還有相當(dāng)一部分處于5'-UTR區(qū)。這與觀察的RPFs片段5'端核苷酸分布是一致的腺占。
即如下圖5′ ends of the footprint fragments started abruptly 12 to 13 nt upstream of the start codon, ended 18 nt upstream from the stop codon.
原因不難理解淤袜，可參看上面第三張圖（40s、60s）湾笛，即核糖體內(nèi)翻譯密碼子的位置是固定的（P site饮怯、A site）
image.png
（3）三密碼子周期性
- 對于任意一個(gè)密碼子，frame 0/1/2分別代表5'→3'的三個(gè)核苷酸
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而從RPFs片段5'端第一個(gè)堿基的分布可以看出明顯的3nt周期性嚎研。
image.png -
即大部分是落在每個(gè)密碼子的frame0位置蓖墅；而反映在分布圖中，則是每三個(gè)位置出現(xiàn)一個(gè)峰临扮，也進(jìn)一步驗(yàn)證了三核苷酸密碼子的翻譯準(zhǔn)則论矾。
image.png
2.3 應(yīng)用范圍
- 上面2.2只是初步展示了ribo-seq的數(shù)據(jù)特征，還有很多更深入的探索杆勇，例如ORF有關(guān)的Translation Efficiency (TE)計(jì)算等贪壳，可以參看相關(guān)ribo-seq應(yīng)用文獻(xiàn)。
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Ribo-seq的應(yīng)用范圍蚜退，如下圖可涵蓋四個(gè)方面
（1）應(yīng)用于翻譯探究機(jī)制
（2）深化轉(zhuǎn)錄組分析
（3）用于解釋轉(zhuǎn)錄組與蛋白組結(jié)果的不一致
（4）可以深化非編碼RNA的測序分析
image from 達(dá)澈生物
最后推薦兩篇文獻(xiàn)闰靴，一篇是2009年第一次提出ribo-seq；另一篇是2017年對于riboseq的綜述钻注；筆記中的例圖基本都來自這兩篇文獻(xiàn)蚂且。
- Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling
- Beyond Read-Counts:Ribo-seq Data Analysis to Understand the Functions of the Transcriptome
需要這兩篇文獻(xiàn)的朋友可以在評論區(qū)留言郵箱，我看到后會發(fā)給大家的幅恋。
